布鲁氏菌持续性感染机制研究进展

张 倩 , 孙天浩 , 张 辉 , 陈创夫 , 王 震

(1.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所 ， 新疆 石河子 832000 ; 2.石河子大学动物科技学院 ， 新疆 石河子 832000 ； 3.西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新中心 ， 新疆 石河子 832000)

布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生菌，其引起的布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种严重危害人和家畜健康的人兽共患传染病，可以引起人的波浪热，母畜流产以及公畜睾丸炎等症状，严重阻碍畜牧业的发展和公共卫生安全[1]。布鲁氏菌没有经典的毒力因子，如荚膜、外毒素、菌毛和质粒等，在长期进化过程中，布鲁氏菌从一种营自由生活的古细菌进化成为胞内寄生的病原菌，最终演化为具有宿主偏好性的不同种布鲁氏菌。同时，布鲁氏菌通过弱化毒力，形成了一系列“隐藏”策略，躲避宿主细胞的杀伤以及逃逸宿主的抗感染免疫，从而可以在宿主体内长期存活，建立持续性感染[2]。因此，深入了解布鲁氏菌适应性调节能力，尤其是布鲁氏菌的免疫逃逸能力，将有助于理解胞内病原菌的致病机制，为防治布鲁氏菌的相关疾病研究提供理论基础，并对抗病原微生物感染药物的研发具有重要意义。

1 布鲁氏菌对胞内微环境的适应

1.1 对氧化损伤的抵抗 宿主细胞产生的ROS(如O2-和H2O2)对于胞内布鲁氏菌的杀伤和酸化至关重要。然而，布鲁氏菌胞质中的超氧化物歧化酶可以保护细菌抵抗内源性的O2-，使其难以穿过细菌的细胞膜，从而发挥隔离防护作用。另外，胞质中的SODs(SodA、SodB等)可通过有氧代谢途径抵抗内源性O2-。研究发现，布鲁氏菌产生的SodC能够保护牛种布鲁氏菌2308抵抗宿主细胞的氧爆发作用，而且是建立小鼠慢性感染所必需的毒力因子。布鲁氏菌周质中的过氧化氢酶KatE和AphC是抑制内源性H2O2的主要抗氧化剂，KatE具有排出超生理限度H2O2的作用，而AphC似乎是内源性H2O2的主要清除剂[3]。布鲁氏菌除了具有逃避ROS杀伤能力外，也具有间接避免氧化损伤的机制。在其他细菌中已经被证实，细胞色素氧化酶和细胞色素C对O2-具有高亲和力，而且O2-“清除”细胞色素氧化酶的能力与ROS的毒性密切相关[4]。在细胞模型和动物模型中，细胞色素氧化酶和细胞色素C对于布鲁氏菌生存是必需的，而且在所有活细胞中，DNA是ROS介导细胞杀伤的主要靶标，已有研究显示：DNA修复途径在保护布鲁氏菌体外免受ROS杀伤过程中发挥着重要作用[5]。

1.2 对亚硝基化损伤的抵抗 在小鼠巨噬细胞中，一氧化氮合酶(iNOS)产生的一氧化氮(NO)对控制胞内布鲁氏菌的繁殖发挥着重要作用[6]。布鲁氏菌产生的一氧化氮还原酶(Nor)除了具有反硝化的代谢作用外，也对胞内布鲁氏菌繁殖过程中NO的排出发挥重要作用。ROS-RNI复合物被认为是宿主巨噬细胞抗菌库的重要组成部分，具有高效的杀菌活性。沙门菌、分枝杆菌和幽门螺旋杆菌的AhpC蛋白已证实具有过氧化亚硝酸盐还原酶的活性[7]。而在布鲁氏菌的研究中，AhpC突变株可增加体外布鲁氏菌对过氧化亚硝酸盐ONOO-的敏感性，但是布鲁氏菌的AhpC蛋白是否具有保护细菌免受ONOO-杀伤的作用还有待于进一步证实[8]。

1.3 对酸性pH的抵抗 布鲁氏菌感染宿主细胞的早期阶段，布氏小体发生酸化，布鲁氏菌virB基因编码的IV型分泌系统在布氏小体的酸化过程中发挥着重要作用[9]。随着研究的深入，与布鲁氏菌抗酸特性相关的分子被不断的发掘和发现，胞质分子伴侣HdeA被证实在大肠杆菌和志贺氏菌的抗酸过程中发挥重要作用[10]。牛种布鲁氏菌hdeA基因缺失后，其抵抗酸性pH的能力显著降低，但该突变株在小鼠模型中毒力并未降低[11]。布鲁氏菌Ca2+结合蛋白Asp24与RNA分子伴侣Hfq参与了布鲁氏菌对酸性条件的调控，但其调控机制尚未明确[12]。对布鲁氏菌的比较基因组学研究发现，大多数布鲁氏菌具有脲酶基因，不仅可以抵抗极低pH(pH=2)环境，而且也可保护布鲁氏菌口服疫苗抵抗宿主胃肠道中的酸性条件。然而也有研究表明，脲酶并不具有保护布鲁氏菌在宿主细胞内抵抗酸性条件的作用[13]。

1.4 对抗菌肽的抵抗 布鲁氏菌相对于其他革兰阴性菌具有更高的抵抗胞内阳离子肽的能力，这种能力与布鲁氏菌脂多糖(LPS)脂质的酰基化有关，可保护细菌降低与溶酶体融合过程中裂解肽的杀伤作用[14]。

1.5 对营养胁迫的抵抗 布鲁氏菌在宿主细胞内生存繁殖会遭遇营养胁迫作用，O2是宿主限制的主要营养物质之一，细胞色素氧化酶或脱氮途径有助于布鲁氏菌在低浓度O2条件下进行呼吸作用。碳水化合物的运输和代谢途径是布鲁氏菌胞内繁殖所必需的，而牛种、羊种布鲁氏菌能够利用赤藓糖醇作为替代碳源[15]。金属离子摄取系统不仅是布鲁氏菌重要的毒力因子，也是病原菌在长期进化过程中应对金属离子极度匮乏形成的一套适应机制。近年来，大量的证据证明Fe2+、Mg2+、Zn2+和Mn2+的高效运输对于布鲁氏菌的胞内存活至关重要[16]。

2 布鲁氏菌调控胞内运输途径

布鲁氏菌通过非调理作用侵入宿主细胞后，含有布鲁氏菌的液泡(BCVs)，又称为布氏小体，通过胞内运输途径最终到达其复制区域。在胞内运输的初始阶段BCVs与溶酶体短暂接触，导致其迅速酸化，随后与内质网(ER)发生相互作用，使胞内pH上升以有利于布鲁氏菌的复制繁殖。而在上皮细胞中，BCVs具有类似于自噬体的功能，自噬可能是一种宿主防御机制，用于对抗侵袭的布鲁氏菌[17]。但目前研究显示，布鲁氏菌诱导的非典型自噬，有利于布鲁氏菌逃避宿主细胞的杀伤，从而达到复制的目的[18]。布鲁氏菌毒力因子VirB由12个基因构成，编码布鲁氏菌IV型分泌系统，VirB操纵子可被BCVs的酸化作用特异性激活。布鲁氏菌VirB突变株侵袭细胞时，具有与野生型布鲁氏菌相同的侵袭能力，证明其不是布鲁氏菌侵袭所必需的，但在宿主细胞中，VirB对调控布鲁氏菌胞内运输及生存必不可少[19]。

β-环葡聚糖(cβG)是调控布鲁氏菌胞内运输的另一个关键分子，β-环葡聚糖在布鲁氏菌胞质中含量丰富，可调节细胞膜的渗透压[20]。布鲁氏菌cβG突变株毒力明显减弱，不能逃避胞内溶酶体的融合，其作用机制可能是由于cβG分子通过减少脂筏中的胆固醇，调节BCVs中的脂筏组分，改变了吞噬泡与溶酶体相互作用构象。cβG的分子结构与β-环 糊精分子相似，而β-环糊精分子对胆固醇和鞘脂的亲和性较高，β-环糊精分子可破坏脂筏，导致细胞裂解。而cβG分子相对于β-环糊精分子具有较低的胆固醇分子亲和性，尽管它可以扰乱脂筏，但它对细胞无毒性作用，也不会裂解细胞。而且cβG分子不依赖于VirB系统转运，也不存在于布鲁氏菌脱落的外膜成分中[21]。因此，cβG分子被释放到BCV中的方式仍有待深入研究。目前科学家推测：部分细菌在宿主细胞内死亡相对大量的cβG分子被释放到吞噬泡中，从而帮助其他胞内布鲁氏菌逃避杀伤并转移到生长繁殖位点。该假说目前已通过两方面得以证明：(1) 巨噬细胞只允许一小部分内化的布鲁氏菌到达内质网；(2)在受感染的细胞中添加外源性cβG分子能够使布鲁氏菌cβG突变株免受溶酶体的融合。

3 布鲁氏菌调控细胞凋亡

操纵细胞程序性死亡是病原体促进其在宿主内生存的主要机制之一。细菌病原体如贝氏柯克斯体或鼠伤寒沙门菌，可以干扰细胞程序性死亡通路，以支持细菌特定感染阶段的活动。目前研究表明，布鲁氏菌感染早期可抑制宿主细胞的凋亡，表明布鲁氏菌已经进化出避免宿主细胞过早死亡的策略，进而达到持久胞内生存繁殖的目的。

在相同组织细胞培养物中，感染布鲁氏菌的细胞生存时间比未感染的细胞显著延长，且只有活菌感染才能实现布鲁氏菌的凋亡保护作用[22]。另外，凋亡保护作用的实现需要TLR4或TLR2的参与，在这两种受体同时缺失的情况下，受感染巨噬细胞的寿命锐减；而且Myd88缺失的巨噬细胞其寿命也未被延长，这表明巨噬细胞抗凋亡需要细胞因子的参与[23]。同时研究发现，布鲁氏菌O-链多糖可抑制巨噬细胞凋亡，从而有利于胞内细菌的存活。然而，纯化的Br-LPS进入宿主细胞后，抑制凋亡的现象未能出现，说明凋亡抑制作用与粗糙型布鲁氏菌Br-LPS的分子结构和生理变化有关[24]。

4 布鲁氏菌逃避先天性免疫应答

布鲁氏菌是从营自由生活的α-变形杆菌属进化成为胞内寄生菌的过程中，其基因组逐渐缩小、细菌质粒被移除、某些代谢途径被精简，而且与先天免疫反应相识别的布鲁氏菌结构也发生了改变。这些论点被以下3个现象证明：(1)布鲁氏菌诱导的促炎症反应明显低于人苍白杆菌诱发的促炎症反应，人苍白杆菌是已知与布鲁氏菌亲缘关系最近的条件性病原菌[25]；(2)布鲁氏菌不同成员外膜成分差异较小[18]；(3)不同生存状态下的布鲁氏菌关键PAMP相关分子结构变化少且不明显。而与变形杆菌γ和β亚类的病原(如沙门菌或奈瑟菌)相比较，布鲁氏菌缺少很多与毒力相关的典型结构，如纤毛、菌毛、荚膜和质粒。同时布鲁氏菌的自身结构成分对先天免疫的诱导较弱[26]。体内和体外试验研究显示，布鲁氏菌繁殖不依赖于TLR4、TLR3、TLR2、TLR5或TRIF接头蛋白，而且巨噬细胞IL-1β和IL-18受体对布鲁氏菌的胞内生存也不是必需的[23]。这些现象说明，布鲁氏菌PAMPs(如Br-LPS、脂蛋白、鸟氨酸脂和鞭毛等)缺乏足够的活性。此外，内膜蛋白BacA缺失可诱导机体产生较强的促炎症反应[27]，暗示某个PAMP的修饰或改变可影响先天免疫应答反应。由于布鲁氏菌的Lipid A比典型的LPS脂肪酸链(C12-C16)含有更长的脂肪酸链(C28)，所以其与TLR4受体蛋白MD-2的结合力变弱，从而逃避TLR4的识别，大大降低了TLR4诱发的炎症反应。同时布鲁氏菌LPS的O-抗原缺乏自由羟基，因此不能与补体结合，从而抑制了C3a和C5a促炎补体的生成。而且布鲁氏菌的鞭毛由于肽段中氨基酸的变化不能激活TLR5，因此也不能诱导促炎反应[28]。

5 布鲁氏菌调节适应性免疫

布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，主要寄生在巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞内，从而影响免疫细胞功能的发挥，逃避宿主免疫系统的攻击。研究表明：布鲁氏菌可以在体内或体外树突状细胞中生存繁殖，并抑制树突状细胞的成熟和活化。而未成熟的树突状细胞不能诱导促炎性细胞因子TNF-α和IL-12的分泌，从而导致TNF-α不能激活吞噬细胞的杀菌活性，IL-12也不能激活Th1免疫反应生成IFN-γ，使布鲁氏菌逃避IFN-γ介导的I型免疫反应的杀伤；同时布鲁氏菌对树突状细胞成熟的抑制也影响了其表面MHC分子的表达，从而抑制了抗原递呈；已有报道显示，布鲁氏菌LPS可以调节外源性抗原的递呈作用[29]，这可能与布鲁氏菌LPS的非典型结构有关。实际上，Br-LPS可以阻碍巨噬细胞通过MHC-II分子将某些蛋白递呈给特异性T细胞。同时在B淋巴细胞中，Br-LPS在含有MHC-II分子的溶酶体样隔室中被富集，而这些隔室具有特殊的抗原“装载”和加工位点。在巨噬细胞中Br-LPS运输速率比蛋白质的运输速率慢，最终Br-LPS分子被运输到巨噬细胞表面形成由脂筏、MHC-II类分子和Br-LPS等混合物构成的结构簇，而布鲁氏菌LPS独特的O-链结构阻碍了其与T淋巴细胞受体的识别[30]。总之，这种现象可以解释某些病原菌表现出的免疫逃避现象，在一定程度上也可以解释了慢性布病患者细胞免疫相对抑制的机制。

6 展望

细胞内细菌与宿主之间的关系非常复杂，涉及多种生物学因素和信号途径。作为一种兼性的胞内细菌，布鲁氏菌在与宿主之间不断发展的相互作用中，通过躲避宿主细胞的杀伤以及逃逸宿主的抗感染免疫，可以在宿主体内长期存活，建立持续性感染，同时其通过对胞内微环境的适应，调控胞内运输途径以及细胞凋亡，从而处于一个长期进化的过程。尽管布鲁氏菌的持续性感染的机制调控的研究仍在进行中，但仍有许多问题有待进一步解释。因此进一步明确布鲁氏菌参与的不同生物学过程，将为疾病的预防和控制，以及疫苗开发提供新的思路。