奶牛肝脏功能及其免疫调节作用的研究进展

牛 慧 童津津 熊本海 蒋林树*

(1.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京102206；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193)

肝脏是奶牛重要的营养代谢、解毒以及免疫器官。肝脏在奶牛乳腺组织合成乳过程中提供了主要的糖异生作用产物，同时在脂质代谢和氨基酸代谢中也发挥着核心作用[1]。在奶牛代谢过程中，来自于消化道中的营养物质以及微生物抗原物质等经门静脉到达肝脏，还有一部分抗原物质随富含氧的血液经肝动脉到达肝脏，激活肝脏的免疫防御机制。目前已发现多种疾病与奶牛的肝脏免疫相关。Byrne等[2]研究发现，肝吸虫感染奶牛肝脏后，对奶牛免疫应答以及奶牛分枝杆菌结核病的诊断存在一定的干扰作用。常广军等[3]研究表明，饲喂高精料饲粮导致的奶牛亚急性瘤胃酸中毒(SARA)与肝脏免疫基因启动子区域DNA甲基化率降低、肝脏免疫相关基因表达增强有关。Trevisi等[4]指出，可以通过监测泌乳早期肝脏炎症反应的生物标志物，如C反应蛋白(CRP)、铜蓝蛋白(CP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、结合珠蛋白(Hp)来监测奶牛的健康状况，以维持奶牛较高的生产性能。

肝脏中的枯否氏细胞(Kupffer cell，KC)、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)、树突状细胞(dendritic cell,DC)、肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)等构成了肝脏的非实质部分。肝细胞是肝脏实质部分的基本组成单位，其主要通过表达并分泌大量的天然免疫蛋白进入血液来抵御微生物的入侵[5]。这些蛋白质包括具有杀菌作用的补体蛋白(complement proteins，CP)，增强吞噬作用的免疫调理素(immune opsonin，IO)，调节脂多糖(LPS)信号的可溶性因子，以及激活天然免疫的凝血因子纤维蛋白原(fibrinogen，FG)。肝脏非实质细胞连同肝细胞参与复杂的局部和全身免疫功能。来自肝动脉和门静脉的大量血液经过肝脏滤过之后，废弃物以及毒害物质由胆汁排到肠道，随粪便排出体外。此外，肝脏在肝-脑轴中占有关键位置，这一神经轴主要通过维持奶牛各项生理功能正常运行，特别是调控奶牛肝脏合成葡萄糖、维持血糖稳态来发挥作用。

1 肝脏中的免疫相关细胞

1.1 枯否氏细胞

枯否氏细胞是一种巨噬细胞，存在于肝血窦内，其占天然巨噬细胞总数的80%～90%[6]，是抵御来自门静脉血液中免疫反应性物质的第1道防线。枯否氏细胞通过模式识别受体如Toll样受体(TLRs)、RIG-Ⅰ样受体(RLRs)、NOD样受体(NLRs)和C型凝集素受体(CLRs)，识别病原相关分子模式和损伤相关分子模式[7]。当枯否氏细胞被激活后释放各种细胞因子、趋化因子以及可溶性生物介质。Toll样受体4(TRL4)在内毒素的识别以及信号转导中起着重要的作用。在LPS型奶牛乳腺炎中，LPS诱导TLR4激活后，通过髓系分化因子88(MyD88)依赖和非依赖途径，诱导核因子-κB(NF-κB)与促炎基因的结合，导致促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的产生[8]。在奶牛处于SARA状态时，NOD样受体1(NLR1)被肽聚糖的降解产物二氨基庚二酸(DAP)激活，使同型的半胱天冬酶(Caspase)活化与募集结构域(CARD)反应，通过招募下游的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体相互作用蛋白2(RIP2)，与NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)亚基结合，促进IκB的磷酸化，最终致使炎性细胞因子过量表达[9]。RLRs能够识别单链RNA、双链RNA病毒。最近已经有研究报道，口蹄疫病毒、肌病毒、牛痘病毒能够引起奶牛乳腺炎[10-12]。被激活的RLRs及其CARD，通过与线粒体内的抗病毒信号蛋白相互作用，激活干扰素调节因子3(IRF3)和NF-κB，启动信号转导途径[13]。

1.2 肝窦内皮细胞

肝窦内皮细胞是肝脏中数量最多的非实质细胞，在清除大分子物质以及抗原呈递方面起着重要的作用。清道夫受体是肝窦内皮细胞表达的典型识别受体，由于肝窦内皮细胞上面有很多窗孔，基底膜物质少，大分子物质不能通过，故将这些物质输送至肝细胞进行代谢[14]。此外，肝窦内皮细胞还能吞噬抗原呈递给T细胞，诱导免疫耐受[14]。肝窦内皮细胞对大多数肝病的发生发展具有重要的调控作用。从妊娠晚期过渡到哺乳早期这一段时间内，很多高产奶牛由于被持续饲喂高精料型饲粮而造成过度肥胖，奶牛产后食欲不振，为了维持正常泌乳，便动用机体脂肪和肌肉中的能量。其中脂肪在各种酶的作用下转化为游离脂肪酸，通过血液到达包括肝脏在内的全身器官，并在肝细胞中以甘油三酯的形式积聚，形成脂肪肝。相似的是，在奶牛身上观察到的脂肪肝与人类的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)有许多共同之处[15]。Mcmahan等[16]关于NAFLD的研究表明，肝窦内皮细胞主要通过调控血液中脂质和脂蛋白的转运，参与脂肪肝的病理调控过程。Kuhla等[17]利用双向凝胶电泳(2-DE)和飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术比较了正常饲喂奶牛与限饲奶牛的肝脏组织，蛋白质组学结果表明，催化胆固醇和磷脂在膜之间交换的甾醇载体蛋白2在限饲奶牛中含量更高，表明脂质运输增加，这强调了肝窦内皮细胞在奶牛脂肪肝形成过程中的重要调控作用。

1.3 树突状细胞

树突状细胞主要位于肝脏门脉基质、胆管及肝窦附近，是一种专业的抗原提呈细胞[18]。树突状细胞不仅能够介导肝脏免疫系统的激活，其在炎症反应过程中也起着关键作用。Barfoot等[19]研究表明，从反刍动物绵羊的肝脏中分离出来的树突状细胞表面有丰富的免疫球蛋白和Ⅱ类组织相容性抗原，后者由主要组织相容复合物(MHC)编码，其在动物体免疫机能中发挥着重要作用。叶素成[20]采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术探究了奶牛MHC与奶牛乳中体细胞数(SCC)的关系，结果表明，MHC的DRB3基因位点存在多态性，其中Hae ⅢAA基因型与高SCC呈显著的相关关系，这为检测奶牛乳腺炎提供了一定的参考依据。

1.4 肝星状细胞

肝星状细胞占肝脏固有细胞总数的15%，主要负责代谢和贮存维生素A，并储存脂肪，从而为肝细胞提供能量[21]。刘一诺[22]研究发现，荷斯坦奶牛和夏洛莱肉牛杂交后代的肝星状细胞中存在调节脂肪代谢的刺鼠信号蛋白(ASIP)基因，同时指出ASIP基因调节牛乳腺上皮细胞中的脂肪酸代谢过程。在乳房链球菌(S.uberis)引起的奶牛乳腺炎中，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路与TLRs/NF-κB信号通路之间的相互作用促进了炎症反应[23]，因此可以将阻断PI3K/AKT信号通路作为治疗S.uberis型乳腺炎的方案之一。现已有研究表明，褪黑素能够显著抑制人类肝星状细胞中PI3K/AKT信号通路的激活[24]，这为治疗S.uberis型奶牛乳腺炎提供了有力支持。

2 肝脏合成并分泌入血的免疫相关活性物质

2.1 补体蛋白

补体蛋白是组成先天免疫系统的重要部分，主要在肝脏中合成。补体被激活之后最终形成膜攻击复合物，后者通过嵌入感染细胞或者病原体的细胞膜，发挥杀菌作用[25]。所以，奶牛的补体水平在很大程度上反映了奶牛的免疫性能。Min等[26]使用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)定量蛋白质组学技术比较了热应激状态下奶牛的血浆差异，结果发现，热应激使奶牛的血浆补体蛋白水平明显下降，免疫功能受到损伤。而且，热应激还会影响肝脏糖异生基因的表达[27]。Ghaffari等[28]利用定量串联质量标签(TMT)方法比较了正常奶牛和过度调理奶牛从妊娠晚期到泌乳早期的血浆差异，蛋白质组学结果表明，过度调理会使奶牛的补体蛋白水平下降，特别是补体3和补体3d水平较低。补体3的水平在血清中很高，在免疫系统中具有核心地位。Jacob等[29]也在亚临床乳腺炎奶牛的牛乳中发现了补体3的激活，并肯定了其作为亚临床型乳房炎诊断标记物的潜力。因此，补体蛋白是反映奶牛肝脏健康及机体免疫水平的重要指标。

2.2 免疫调理素

免疫调理素是一种具有调理作用的免疫活性分子，除补体外，还包括CRP、SAA、甘露糖结合凝集素等物质[30]。免疫调理素可与细胞上的特异性受体相互作用，促进吞噬细胞吞噬病原体或病毒感染细胞。在机体发生急性炎症或被感染时，肝细胞迅速产生急性期蛋白CRP和SAA，二者与免疫细胞上的Fc受体结合介导胞吐作用，从而促进体内大分子物质的清除[5]。Ilievska等[31]研究发现，奶牛的蹄部疾病患病情况，如足跟角糜烂、足底溃疡、足底皮炎等，与血清中的急性期蛋白有关，特别是HP和SAA，可作为奶牛蹄病早期检测的有价值的生物标志物。甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)是补体系统的功能中心酶，其单核苷酸多态性(SNPs)与奶牛的乳房炎和产奶量有关系。Zhang等[32]指出，在中国荷斯坦奶牛MASP2基因的SNPs中，基因型AC(g.14047A>C)和TT(g.14248T>C)以及单倍型组合H2H2和H2H4可作为奶牛抗乳房炎育种的分子标记。

2.3 脂多糖结合蛋白(LBP)、可溶性CD14和可溶性MD-2

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，与TRL4-MD2复合物结合，激活炎症信号通路。LPS向TLR4-MD2的转移是由LBP和CD14共同催化的[33]。CD14是一种锚定蛋白，是LPS的细胞膜受体。LBP与LPS的类脂A高度亲和，形成复合物后与CD14识别结合，形成LPS-LBP-CD14三联复合体[33]。随后LPS被LBP和CD14转移到TLR4-MD2复合物中，诱导二聚化，这使得TLR4的胞质Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域足够接近，以招募下游衔接分子，如MyD88、含有TIR结构域的接头蛋白(TIRAP)、含有TIR结构域诱导产生β-干扰素的接头蛋白(TRIF)和TRIF相关的接头分子(TRAM)[34]，最终诱导参与宿主免疫反应基因的表达。LPS感染对奶牛机体的影响是多方面的，如LPS以时间依赖方式降低甾醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)的表达，诱导奶牛乳腺上皮细胞中的乳脂产量降低[35]；卵泡液中的LPS可能通过破坏类固醇合成和排卵机制诱发奶牛囊性卵巢疾病[36]；LPS能够诱导奶牛子宫内膜炎，致使受孕率降低、从产犊到第1次分娩的间隔时间增加、因不孕而被淘汰的奶牛数量增加等[37]。

2.4 纤维蛋白原

纤维蛋白原是一种由肝细胞合成的具有凝血和止血作用的糖蛋白，由α、β、γ 3对多肽链构成[38]。在凝血酶作用下，α链与β链分别在细胞中释放出A肽与B肽，转化为纤维蛋白单体，最终形成纤维蛋白聚合物[39]。有趣的是，凝血与天然免疫之间存在着重要联系。越来越多的研究表明，凝血因子不仅起到物理屏障保护的作用，还能控制入侵的微生物保持在局部，阻止其进入血液循环扩散[40]。Påhlman等[40]指出，从纤维蛋白原β链释放的肽段GHR28对与纤维蛋白原结合的细菌具有抗菌活性，但非结合菌株不受影响。这种抗菌作用是通过GHR28对细菌的结合能力实现的，主要针对A组和B组链球菌有效，而对金黄色葡萄球菌和卡他莫拉氏菌的作用不明显。Papareddy等[41]的研究也表明，在纤维蛋白中检测到的凝血酶衍生肽，可通过膜溶解方式有效地杀灭微生物，在动物模型中对铜绿假单胞菌败血症和LPS诱导的休克具有防御作用。在奶牛养殖过程中，乳腺炎致病菌的主要类型有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。纤维蛋白原多肽在奶牛乳腺炎治疗上的应用还未见报道，在治疗大肠杆菌以及无乳链球菌型奶牛乳腺炎时是否可以将纤维蛋白原多肽作为替代抗生素的选择值得进一步探究。

3 肝-脑轴

肝-脑轴参与调控多种信号通路。在肝脑炎症信号通路中，炎症因子激活肝脑迷走神经，迷走传入神经将信号投射到大脑。炎症因子作用于大脑内皮细胞受体，进而激活各自的炎症信号通路[42]。在肝脑葡萄糖信号通路中，肝-脑轴通过自主神经系统对胰岛素的中枢作用从而调节肝脏血糖水平。血糖不仅可以为机体提供能量，而且也是提高机体免疫力的重要部分。曲明姿等[43]研究表明，高产奶牛与低产奶牛相比血糖水平显著降低，这可能与高产奶牛产奶量大、消耗的糖量大有关。而且，奶牛产后血糖水平也是预测奶牛酮病是否发生的重要指标。而在免疫系统中，自然杀伤(NK)细胞是机体重要的淋巴细胞，能够迅速释放穿孔素、细胞因子、肿瘤坏死因子(TNFs)等，非特异性地杀伤异常细胞[44]，并通过调节其他免疫细胞调动机体的天然免疫机能。有研究表明，在高血糖患者的外周血中存在白细胞介素-2(IL-2)受体[45]，其通过阻碍IL-2与NK细胞接触，降低NK细胞的活性，进而降低机体的免疫力。目前，肝-脑轴对血糖水平的调控在奶牛生产和健康中得到了更多的关注，而其对免疫功能的影响还需要深入探究，因此可以将肝-脑轴在免疫功能中的作用作为创新点，进一步完善奶牛免疫功能的调节机制。

4 小 结

奶牛肝脏免疫是一个复杂的调节过程，涉及到肝脏中的各种免疫相关细胞以及肝细胞合成并分泌入血的免疫相关活性物质，同时肝脏还通过肝-脑轴在奶牛机体免疫中发挥不可替代的作用。奶牛肝脏免疫与许多疾病的发生密切相关，所以，了解奶牛肝脏免疫能够更好地理解奶牛疾病的诱因、发病机制及治疗方法，意义匪浅。