生防细菌杀松材线虫的作用机制及应用

张弘弢赵宇李晓岩牛犇

(1.东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040；3.牡丹江师范学院化学化工学院，黑龙江牡丹江 157011)

松材线虫病又称松树枯萎病(Pine wilt disease，PWD)，是由松材线虫Bursaphelenchus xylophilus引起的一种全球性森林病害，可危害70种针叶树，其中松属Pinus树种57种，非松属树种13种[1]。松材线虫病可导致树脂管周围空化和无法修复的木质部导管功能障碍[2]，该病危害性极大，被称为“松树的癌症”，已成为我国近几十年来发生的最严重、最危险的林业病害[3]。松材线虫作为外来入侵林业检疫性有害生物，对我国主要针叶绿化树种造成的经济损失和生态影响巨大，松褐天牛Monochamus alternatus是松材线虫最主要的传播媒介，分析松褐天牛种群发生动态能够评估松材线虫病的灾变风险[4-6]。目前防治策略多以防治松褐天牛为主，亟需建立松材线虫病高效防控技术体系。

当前防治松材线虫病的主要措施包括疫木粉碎、熏蒸、焚烧与施用化学药剂，通过直接或间接杀死传播媒介松褐天牛等。粉碎、熏蒸与焚烧疫木过程中的监管疏漏将会加速该病害的扩散[7-8]；化学药剂的残留，不仅会造成耐药病原物的产生，加大防控难度，而且会对环境造成沉重负担；有些防治办法在杀死松褐天牛的同时，也会杀死大量害虫天敌，造成其他虫害的发生。生物防治是指利用有益生物及其代谢产物防治有害生物的一种重要策略，具有防病功能的有益微生物菌株已被广泛应用于植物病害防控。生物防治松材线虫不仅能够从源头上遏制松材线虫病的蔓延，还能降低防治松褐天牛带来的危害。利用细菌防治植物病虫害具有安全环保、对病原生物高度特异性，调节土壤细菌群落，提高其抗逆能力等优点，有利于防治工作可持续发展。国内外广泛利用细菌及其代谢产物防治松材线虫病，使松材线虫病的生物防治策略迅速发展[9-12]。目前，已被广泛商品化的杀线虫细菌菌株主要来自于荧光假单胞Pseudomonas fluorescens，芽胞杆菌属Bacillus、放线菌Actinomycetes、巴氏杆菌属Pasteuria等[13-14]。采用枯草芽胞杆菌Bacillus subtilisB006的无菌代谢产物处理根结线虫Meloidogynespp.2龄幼虫(J2)48 h后的致死率达100%，对黄瓜根结线虫病的防治取得了良好效果[15]；放线菌S07不仅对小麦胞囊线虫Heterodera avenae具有防治效果，而且能够在盆栽与田间条件下防控番茄根结线虫[16-17]；枯草芽胞杆菌AR11能够防控南方根结线虫Meloidogyne incognita[18]，进一步研究发现，将该菌株与芽胞杆菌NJ08、NJ218混合制成GJ23复合菌剂，能有效抑制虫卵的产生[19]，在田间试验中，该复合菌剂对根结线虫的防病效果达到51.9%[20]。

深入研究生防细菌的作用机理，能够促进生防菌剂应用与商品化；通过对生防细菌及其代谢产物的研究，能够大规模生产有效的生防制剂，节约经济成本；进一步对生防细菌的分子生物学特性与毒力基因的研究，可生产有效性、专一性、针对性更强的生防制剂；现代发酵技术加快了生防菌剂工厂化生产和商品化应用，这使以防为主，防治并举，防重于治的理念得到进一步的完善。为使生防细菌在防治松材线虫病过程中达到更好的作用效果，需对其与松材线虫的相互作用机理有更深入的了解。

1 细菌杀松材线虫的作用机制

松材线虫是一种迁移性内寄生虫，具有复杂的生命周期。当环境适宜时，松材线虫卵经过繁殖型1～4龄幼虫阶段发育为成虫。当食物匮乏和线虫密度过高时，不同于秀丽隐杆线虫Caenorhabditis Elegans从繁殖型2龄幼虫进入dauer期，松材线虫会进入一个类似于dauer期的扩散阶段，繁殖型2龄幼虫蜕皮到D3阶段[21-22]，D3阶段线虫可在病媒甲虫身体中蜕皮为D4阶段[23-24]。使用RNA-seq对松材线虫的所有发育阶段进行了全面的转录组分析，其中9 000个基因与一般线虫生物学没有差异，分散阶段的转录组与秀丽隐杆线虫相似[25]。根结线虫在植物根表形成伤口进行侵染，D4阶段的松材线虫也能通过媒介昆虫松褐天牛在啃食树皮上留下伤口，通过伤口传播到新的健康寄主树上[26-27]。松材线虫与大豆胞囊线虫Heterodera glycines、根结线虫同属植物寄生线虫。细菌杀其他线虫的作用机制可能也适用于松材线虫。

细菌杀线虫的主要作用机制包括毒素致死、消解线虫体表组织、干扰线虫行为模式、捕食线虫与细菌动员真菌捕食线虫等。细菌可以通过一种或者多种作用机制杀死线虫。

1.1 毒素致死 苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)作为微生物源低毒杀虫剂，以肠毒作用为主。该菌产生的毒素能使线虫肠道溃疡，停止取食，最后线虫因饥饿和神经中毒死亡。

苏云金芽胞杆菌可产生多种具有杀虫作用的伴胞晶体蛋白毒素，主要包括α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素和δ-内毒素，其中β-外毒素和δ-内毒素具有线虫致死活性。线虫吞食的伴胞晶体蛋白毒素，在肠道碱性条件(pH＞10)下，可被某些酶降解为毒素核心(toxin core)，分子量65～75 kD。毒素核心与线虫肠道上皮的受体相结合，并插入到细胞膜上形成离子通道，导致渗透平衡破坏，引起肠内膜渗透性增大，破坏线虫肠道组织，线虫虫体发生肿胀并裂解，最终导致线虫死亡[28-29]。

δ-内毒素，主要分为Cry(crystal)和Cyt(cytolyic)两类[30]。Cry毒素可与位于线虫肠道细胞膜表面的特定受体相互作用，并在与受体结合后被肠道细胞内的蛋白酶激活，从而形成具有插入能力的孔前寡聚结构；Cyt毒素直接与线虫肠道细胞膜脂质相互作用并插入膜中，形成液泡和孔，并最终导致肠道表皮细胞的降解[31]。

此外，苏云金芽胞杆菌毒素可导致线虫中毒。中毒迹象包括线虫肠道细胞收缩和变薄，与体壁细胞形成空泡，线虫本身虫体失水皱缩，体积缩小，行动迟缓，缺乏活力[32]。

1.2 消解线虫体表组织 松材线虫的成虫体表覆盖着致密非细胞表皮，能够保护线虫免受外界侵害，细菌产生的蛋白酶能消解破坏表皮和皮下组织，一旦表皮以及组织受到破坏，就会加速线虫死亡。

侧胞短芽胞杆菌Brevibacillus laterosporus和荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens等分泌的细胞外蛋白酶，能在线虫的体表形成孔洞，并由表皮细胞向内连续降解并消化内部组织[33-35]。人们熟知的芽胞杆菌产生的胞外蛋白酶通过此类作用机制杀死线虫，例如蜡样芽胞杆菌BCM2产生的外排型蛋白酶可以同时伤害线虫表皮和卵膜，导致线虫表皮角质层断裂，形成表皮伤口，卵的发育或停滞在单细胞阶段，或发生不规则的细胞分裂，从而杀死线虫并阻断线虫繁殖[36]。

此外，沙雷氏菌Serratiasp.A88copa 13可产生外排型蛋白酶，在扫描电镜下可以观察蛋白酶沉积物黏附在松材线虫表皮，引起皮内层折叠和褶皱，破坏松材线虫表皮细胞结构，导致线虫死亡[37]。从土壤中分离获得的嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophiliaG2也有类似的作用，其产生的胞外丝氨酸蛋白酶可作用于松材线虫的表皮细胞，使其逐渐裂解消失，体内细胞形成空泡，最终虫体基本消失[38]。

这种作用方式能导致线虫死亡，对正常生长发育的线虫重创，这种伤害是不可逆，不能自我修复的。

1.3 干扰线虫行为模式 松材线虫繁殖和扩散阶段分泌的信号因子，能够保证线虫正常的生长活动，细菌具有的挥发性小分子化合物能够代替信号分子，结合线虫神经元干扰线虫代谢途径。细菌产生的胞外多糖能抑制线虫的运动，通过降低线虫爬行速度来减弱线虫的定殖能力，从而减少侵染寄主植物的线虫种群数量。

芽胞杆菌R2产生的次级挥发性代谢产物苯乙烯，可影响松材线虫的嗅觉神经元和G蛋白信号代谢途径，造成松材线虫神经系统紊乱，导致松材线虫死亡[39]。

多粘类芽胞杆菌PaenibacilluspolymyxaKM2501-1可通过产生多种挥发性代谢产物，诱捕并杀死线虫，其产生的糠醛丙酮和2-癸醇能够吸引线虫，起到“蜂蜜陷阱”的作用[40]。

细菌通过产生包裹其整个群落的外聚合基质形成生物膜。铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa生物膜中含有的胞外多糖Psl能够抑制线虫的运动，Psl通过降低线虫的爬行速度来减弱线虫的定殖能力，能够将线虫捕获在基质中，使线虫既不能从恶劣环境中逃脱，也不能向有利环境迁移[41]。这种作用方式降低了线虫在植物上的定殖，有效减少了线虫的种群数量。

1.4 捕食线虫细菌 覆盖在线虫角质层最外层的表皮层，由各种非结构性的皮下分泌物修饰而成，含有大量的微量元素，胶原和糖蛋白[42]。细菌通过争夺环境中的微量元素，使线虫不能合成构成表皮层需要的结合蛋白，细菌也能够利用线虫产生的胶原和糖蛋白产生生物膜，供自己生长繁殖。

穿刺芽孢杆菌Pasteuria penetrans的孢子附着在线虫幼虫的表皮表面，通过争夺环境中的硒(Se)元素，使线虫表皮缺乏硒结合蛋白(SeBPs)。当幼虫长到成虫期时，孢子长出胚芽形成萌芽管穿透虫体的角质层，利用线虫体内的营养物质形成菌丝最终充满线虫全身，导致线虫死亡，最终释放大量孢子[43]。穿刺芽孢杆菌感染的线虫种群的运动能力明显下降，在其感染后期只存在角质层，没有表皮细胞[44]，这意味着线虫实际上已经接近死亡。

雌性线虫产下的虫卵表面附着一种胶状基质，坚强芽孢杆菌Bacillus firmus可粘附在卵壳上，利用这种基质中的胶原和糖蛋白分子在卵壳表面产生生物膜，并侵入到卵的内部进行定殖，同时引起卵壳糜烂，使虫卵不能正常孵化[45]。有研究认为，坚强芽孢杆菌除了可以显著降低卵的孵化率，还可降低线虫幼虫的运动能力，其产生的次生代谢产物与线虫的麻痹和死亡有密切关系[46-47]。

尽管尚未有研究表明此类细菌在松材线虫上的作用机制，但是有研究表明坚强芽孢杆菌与松材线虫具有种间互作基础[48]，该种作用方式仍可能适用于松材线虫防治。

1.5 细菌动员真菌捕食线虫 具有捕食线虫能力的真菌在感受到宿主线虫后，开始由腐生向寄生生活转变以适应对宿主的侵染。真菌捕食器官的产生标志着生存策略的转变。当环境中缺乏合成真菌细胞壁蛋白的氮源，捕食线虫真菌会产生三维菌丝网，来捕捉环境中的线虫。当环境中无毒的嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia感受到线虫分泌的信号后，通过释放尿素激活真菌的生存策略转化开关，产生捕食器官帮助其消灭线虫[49-50]。如果环境中存在能够产生硝酸盐和酵母浸出物的细菌，可以诱导激活捕食线虫真菌Arthrobotrys oligospora捕食器官的产生[51]。

2020年从中国浙江省采集的515个松材线虫病样品中分离得到此类真菌[52]，为真菌捕食线虫的研究提供了信息，并为今后对松材线虫的生物防治提供了重要依据。

2 生防细菌在松材线虫病防控中的应用

生防菌剂主要通过预防病害的发生来减少植物发病率，有助于减少化学污染，保持生态平衡。因此，利用生物防治措施控制松材线虫及其媒介昆虫越来越受到人们的关注和重视。传统防治松材线虫病一般从寄主松树、媒介天牛、病原线虫上着手，主要方法有及时检疫、局部范围内彻底清除、设立隔离带等[53-54]，但是有环境污染、抗药性、耗费巨大的人力物力财力等问题。

杀线虫生防细菌制剂已经有极为成熟的商品，而且应用历史悠久，以抑制植物寄生线虫为主，控制线虫的数量及种群繁衍。Econem生物农药是拜耳作物科学公司以穿刺芽孢杆菌为主要原材料研制而成的生防制剂，针对多种线虫具有防治作用，目前已经在多国应用[55]，美国的Gustafson LLC生产的芽胞杆菌菌剂能控制番茄，甜椒和草莓上的植物寄生线虫[56]，以色列使用的另一种芽胞杆菌制剂Bio-Nem用于控制根结线虫以及其他线虫[57]，关于其能否对松材线虫产生作用，还有待研究。

防治松材线虫病的生物农药以微生物活体农药和微生物代谢产物农药为主。由毒素致死型苏云金芽胞杆菌JCK-1233开发获得的菌剂，已通过空中喷洒用于控制松材线虫病[58]；能消解线虫的体表组织的嗜麦芽寡养单胞菌Smal-007已被开发为生物防治菌剂用以防治松材线虫病，该菌致病定殖能力强、对环境安全无毒，在安徽、福建等地已经取得了良好的防控效果[59]；大肠杆菌产生的代谢产物紫罗兰素5-O-葡糖苷，对松材线虫有致死活性，已工业化生产[60]。目前干扰线虫行为模式以及细菌动员真菌捕食线虫两类还没有被商业开发，可作为复合菌剂中辅助高效杀线菌株的成分，以增加复合菌剂的稳定性。

就生防效果而言，菌剂对其卵以及幼虫均有杀伤作用的效果要好于专门对成虫具有杀线活性的菌剂。对植物而言，线虫生长的速度越快，种群数量越大，其能造成的破坏和杀伤力也就越大。所以从早期进行生物防治也显得格外重要。细菌生防制剂的开发能够有效克服传统防治方法带来的弊端，但现在细菌致死松材线虫机理没有研究透彻，虽然已经有一些生防细菌制剂应用于小规模的林间试验，但距商品化生产还有很大差距。随着研究不断深入，研究方法不断改进，松材线虫生物防治必将取得长足发展和辉煌成就。

3 讨论与展望

3.1 细菌杀松材线虫与其他线虫的差异 秀丽隐杆线虫是一种在土壤中自由生活的线虫，具有成本低廉、全身透明易于观察、生命周期短、基因组全序列已知且容量小、可操控性强等诸多优点，是研究线虫的模式生物。病原菌粪肠球菌Enterococcus faecalis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae等对于线虫成虫有致死作用[61]，但是由于是病原菌无法成为松材线虫的生防细菌。

植物寄生线虫的生活方式比较特殊，如根结线虫，除2龄幼虫外大部分生活周期都在植物根内完成[62]。因此，杀根结线虫的细菌菌株对植株根系亲和力强，但对在传播载体中寄生的松材线虫作用不大。大豆内生细菌与大豆之间的相容关系具有天然优越性，同时不受外界环境的影响，易于定殖，因而对大豆胞囊线虫病害可能发挥更好的防治效果[63]。关于其他杀线细菌对松材线虫的作用机制还有待于进一步研究。

杀线细菌具有的毒素致死、消解线虫体表组织、干扰线虫的行为模式特点均能够对松材线虫致死，捕食线虫的细菌和细菌动员真菌捕食线虫两种作用方式对杀松材线虫也有较大潜力。

3.2 细菌杀线虫的作用机制不清晰 上述5种杀松材线虫机制较为清楚，但还有一些杀松材线虫的机制并不十分清楚，例如拟南芥拉尔特氏菌Raoultella ornithinolyticaMG通过分泌次级代谢产物致死线虫，这些毒素因子是非蛋白类的，研究表明酯类化合物以及巴比妥酸类似物对松材线虫具有致死活性[64-65]，但没有详细研究说明具体是破坏了松材线虫的哪些基本代谢途径。芽胞杆菌B16会散发出7种吸引线虫的挥发性有机化合物(VOC)，这些化合物能刺激线虫的肠道[66]，后续研究还发现其分泌的蛋白酶能消解线虫的体表组织[33]。干扰线虫行为模式的细菌产生的化合物能够干扰线虫的正常生理活动，但是在线虫的结构组成及神经元受体的信号通路方面没有过多的研究。

捕食线虫的细菌和细菌动员真菌捕食线虫的种间互作机制对环境的要求较高。捕食线虫的细菌往往是在环境中通过营养交换来削弱线虫的抗逆能力再进一步杀死线虫，但环境的作用可能会使线虫进入具有抗逆能力的扩散期，从而很难达到预期效果。毒素致死、消解线虫体表组织和干扰线虫的行为模式已经确定具有杀死松材线虫的作用，捕食线虫的细菌和细菌动员真菌捕食线虫两种作用方式具有杀死松材线虫的潜力，但这些作用方式可能不是单一的，这在已经研究过的其他线虫身上已有证实。

铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa通过多种方式致死线虫，它的铁载体既潜在地促进植物的生长并保护植物，又能与线虫抢夺环境中的铁离子，打破线虫体内铁平衡，而产生的生物膜又能够干扰线虫正常的生长活动[67]。综上所述，细菌能够致死线虫的作用方式并非是单一一种，可能是通过复杂的、复合的作用方式致死，但是在细菌与线虫的种间互作中这些机制尚未研究透彻。

3.3 杀线菌剂广泛应用遇到的问题 对于需要工厂化生产的生防菌剂而言，明确菌株的作用机制至关重要，将有助于实现经济效益最大化，减少工厂的生产成本，优化生产工艺流程。

松材线虫生防科研成果用于工业化生产，除在筛选拮抗细菌、代谢物的分离和提纯等方面做大量工作外，杀线虫的作用机制、生防菌剂的增效和复配以及对环境的影响等是需要解决的问题。细菌产生的代谢产物能应用于生产的一般都是次级代谢产物，在发酵培养基的选择上有着很大困难，既要适合菌体的生长，又需要一定的环境刺激使其产生次级代谢产物。一般而言，活性物质和毒素大都在有机物中，这给实际应用带来了困难。通常可以通过添加增效剂来助溶，更为合理的是通过对其结构进行必要的化学修饰，在增大溶解性的同时也增强其对线虫的作用，这些工作都有待进行。研究结果表明，生防菌剂混合施用对植物寄生线虫的防治有着光明的前景，需要深入研究复配菌剂。生防菌剂防效不稳定性限制了其商业发展，其不稳定因素主要是生防菌之间的互作在根部或土壤中定殖程度不同[68]，所以混合菌剂的开发利用有着广泛的应用前景。

上述5种作用方式均具有开发为生防菌剂的潜力，生防菌剂稳定的防效不仅需要深入研究杀松材线虫的作用机制，还需要科学的根据作用机制复配混合菌剂，这对松材线虫病生防菌剂的开发提供了技术保障。

3.4 展望 以上类型的研究结果与理论知识，揭示了生防细菌利用种间互作增强防病效果的机制，将为控制松材线虫病的蔓延和减轻发病程度提供新思路，也不断为高效生防菌剂的开发提供重要的理论依据。基于对现有研究结果和理论知识的理解与分析，今后的细菌防治松材线虫研究与应用中需重点关注以下几点：

1)深入研究细菌杀松材线虫的作用机制。在研究5种杀线细菌的作用方式上，今后可通过验证文中提及的作用机制，对杀线菌株增强松材线虫病防病效果的机理，特别是分子机理进行深入研究。应特别关注毒素致死，消解线虫体表组织中对线虫的结构性蛋白，基础代谢上的研究。干扰线虫的行为模式类型在线虫的结构组成及神经元受体的信号通路方面没有过多的研究，对于分子间的互作研究方面更是寥寥无几。捕食线虫的细菌和能动员真菌捕食线虫的细菌在其他线虫上的研究基础应该在松材线虫上进行试验，以验证其猜想。深入研究细菌杀松材线虫的作用机制，有利于松材线虫病的防控。

2)利用现代分子生物学技术推动生防菌剂开发。对于毒素致死型杀线细菌，利用基因工程技术可以将产毒素的基因转入到工程菌株中，简化毒素的分子结构，使其能更加稳定有效地作用于线虫靶标。想要提取能够消解线虫体表与组织的蛋白酶，由于其酶所具有的特性，容易变性和失活，利用酶工程加强蛋白酶的稳定性是研究的重中之重。如果研究针对杀线细菌产生的化合物干扰线虫的行为模式，可能需要将物质与线虫、物质与细菌分别研究其作用机制，不应局限于细菌产生物质的分离和鉴定，细菌产生该化合物的条件、生物信息学中的转录组分析更能帮助此类杀线机制的研究。

相较于其他种类杀线细菌，捕食线虫的细菌作用效果慢、时间长，用遗传学进行改良，更快更高效地杀死线虫也是应该突破的难点。如果利用环境生物技术，系统生物学，直接将细菌动员真菌捕食线虫产生的物质添加到环境中，就可以提前预防松材线虫的侵蚀。

利用现代分子生物学技术开展相关研究，可有效解决细菌杀线机制研究与生防菌剂作用开发上的局限性，深刻揭示微生物与松材线虫的互作机制，奠定生物学基础的同时促进生防菌剂的开发与应用。

3)生防菌剂混合施用。施用复合菌剂能解决杀线菌剂广泛应用的局限。细菌与线虫相互作用的重要分子机制及其调控方式，可以为构建高效的杀线虫工程菌株和复配更加高效的生防菌剂提供线索。

最早进行田间应用嗜麦芽寡养单胞菌Smal-007由于其菌株不产胞的特性，工厂化生产较为困难。广为熟知的苏云芽胞杆菌的杀线机理虽然已经研究的较为透彻，但由于其对多数病原菌都有抑菌活性，应用较为广泛，并且长期单一使用一种菌株，会导致耐药性，多效复合的生物防治策略能够有效地解决这些问题。以毒素致死型、消解线虫体表组织两种类型为主，构建高效的杀线虫工程菌株，以干扰线虫行为模式、细菌捕食线虫以及细菌动员真菌捕食细菌等为辅，复配更加高效的生防菌剂，多靶点多方向的作用方式，不仅能稳定菌剂的作用效果，而且能对不同生长阶段的线虫均有致死作用。研究结果表明，生防菌剂防效的不稳定性限制了其商业发展，因此，在林业病害防控压力较大的现状下，将高效的杀线菌株搭配施用，便于在短时间内实现生防制剂的大面积覆盖，有效遏制松材线虫病扩散蔓延，有助于推动林业可持续发展。