非洲猪瘟病毒pS273R蛋白水解酶单克隆抗体制备

张 萌，刘英楠，谢振华，敖清莹，吕 璐， 于婉琪，金文杰，秦爱建，扈荣良，陈鸿军*

(1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241； 2.军事科学院军事医学研究院 军事兽医研究所，长春 130122；3.扬州大学兽医学院，扬州 225009)

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，死亡率可高达100%[1-2]，被我国列为一类动物疫病、世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告疫病。ASFV是非洲猪瘟相关病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的成员[6]。ASFV病毒粒子直径为260～300 nm，为二十面体对称[7]，结构复杂，不同毒株基因组全长不同，为170～194 kb，中央保守区为125 kb，基因组差异主要取决于基因组两端可变区的多基因家族[8]。

ASFV含有151～167个开放性阅读框(ORF)，成熟的病毒粒子中约含50种以上结构蛋白[9]。其中，由pp220水解产生的p150、p37、p34和p14和由pp62水解产生的p35、p15，均存在于成熟病毒粒子中，占结构蛋白总质量的30%[10-12]。已有研究表明：ASFV蛋白水解酶pS273R蛋白能够识别Gly-Gly-Xaa水解位点裂解病毒多蛋白pp220和pp62，产生上述6种主要结构蛋白。pS273R编码1个31 ku的蛋白质，包含1个“核心域”，具有SUMO-1样蛋白酶保守的催化残基。有研究表明,S273R蛋白酶的水解加工可以影响病毒滴度，抑制pS273R蛋白的水解过程，会导致二十面体病毒粒子的组装缺陷[13]。因此，该蛋白酶功能研究将有助于认识ASFV复制过程。本研究通过原核表达ASFVS273R基因，制备纯化抗原免疫小鼠，通过细胞融合，成功制备获得pS273R单克隆抗体。该蛋白抗体旨在为S273R基因缺失毒株的鉴定及pS273R蛋白酶的功能研究提供生物材料。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和实验动物

非洲猪瘟病毒强毒株SY18株由军事兽医研究所保存，并在生物安全三级实验室中在猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)和猪原代骨髓细胞(BM)中扩增及测定感染复数；人胚肾细胞系(HEK-293T)由本实验室保存；SPF级6～8周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 质粒和主要试剂

pET-30a(+)、pCMV-2×Flag载体由本实验室保存；高糖DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；DH5α和BL21(DE3)感受态购自美国Invitrogen公司；限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购自英国NEB公司；T4 DNA连接酶购自美国Promega公司；Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技有限公司；HRP标记兔抗Flag抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG和Alexa Fluor®488标记羊抗鼠IgG购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；ECL显色液购自Pierce公司；GM-CSF购自美国R&D Systems公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和IPTG购自美国Sigma公司。

1.3 S273R基因的合成与重组质粒的构建

根据ASFV SY18毒株S273R基因序列，设计特异性引物，上游为EcoRⅠ-S273R-F：5′-CCGGAATTCATGTCTATATTAGAAAAAATTAC-GTCAAGT-3′；下游为HindⅢ-S273R-R：5′-CCCAAGCTTTTATGCGATGCGAAACAGATG GGTTCTAAA-3′，以SY18病毒基因组DNA为模板，进行S273R基因扩增。PCR扩增体系50 μL：2×Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 25 μL、 上下游引物各2 μL、DNA模板50 ng，ddH2O补至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min； 95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环；72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳后回收并纯化目的片段。目的片段和pET-30a(+)空载体分别经EcoRⅠ/HindⅢ双酶切，纯化回收相应目的片段，T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜。连接产物转化感受态DH5α，涂布于相应LB平板，37 ℃倒置培养，菌液PCR鉴定正确后，送至上海擎科公司测序。测序正确的重组质粒按照小提质粒试剂盒说明书提取质粒，命名为pET30-S273R。定量后,于-20 ℃保存。

1.4 S273R原核表达

将原核表达质粒pET30-S273R转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种于卡那抗性的LB液体培养基，于37 ℃摇床中以 220 r·min-1摇菌12 h后，按1∶100将菌液转接种到1 L卡那抗性LB培养基中摇菌约4 h即OD600 nm=0.6～0.8后，分别加入终浓度为0.5和1.0 mmol·L-1IPTG，37 ℃培养6 h后，4 ℃ 12 000×g离心10 min，收集菌体沉淀。沉淀经PBS洗涤后，冰浴条件下进行超声破碎，12 000×g离心10 min后，分别取上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析，鉴定表达情况并纯化。

1.5 免疫小鼠血清抗体测定

将纯化后的蛋白经BCA蛋白测定试剂盒测定浓度后，腹腔注射免疫6～8周龄BALB/c小鼠：将100 μg蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合并乳化完全，小鼠腹腔注射，首免之后隔7 d用等量不完全佐剂乳化，免疫2次，加强免疫3 d后尾静脉采血，分离血清。利用IFA鉴定小鼠血清是否为阳性，即将ASFV SY18毒株按1 MOI感染PAM细胞24 h，用预冷的丙酮∶乙醇固定液(体积比3∶2)固定5 min， 或利用pFlag-S273R质粒转染293T细胞24 h， 用固定液固定细胞产物。将多抗血清用PBS 1∶100稀释，与固定的细胞于37 ℃反应45 min，PBS洗3遍；加入1∶600稀释的Alexa Fluor®488标记羊抗鼠IgG，37 ℃反应45 min，PBS洗3遍后，于倒置荧光显微镜下观察。

1.6 抗ASFV-S273R单抗制备

选血清抗体阳性反应的小鼠进行加强免疫，72 h 后，按常规方法进行细胞融合和单抗筛选。通过有限稀释法对检出的阳性杂交瘤细胞进行2～3次 亚克隆，直至抗体阳性率达100%时，扩大培养并建株、保种。常规制备腹水，利用间接ELISA测定效价，并用免疫印迹(Western blot)和IFA进一步鉴定后，对腹水进行分装，纯化，置于-80 ℃冻存备用。

1.7 间接免疫荧光检测

将pFlag-S273R质粒转染293T细胞或用ASFV SY18毒株以1 MOI感染PAM细胞，24 h后使用预冷的固定液(丙酮、乙醇体积比3∶2)固定细胞5 min； PBS洗涤3次后，每孔加入100 μL含5%脱脂乳的PBS溶液，于37 ℃封闭1 h；PBS洗涤2次后，加入杂交瘤细胞上清，37 ℃孵育45 min；PBS洗3次，加入100 μL FITC标记的羊抗鼠IgG，于37 ℃ 避光孵育45 min，洗涤3次后，置于荧光显微镜下观察结果。

1.8 间接ELISA测定抗体效价

以pS273R蛋白作为检测抗原，通过间接ELISA法测定抗体效价。即将抗原稀释为浓度1 ng·μL-1， 按每孔100 μL包被ELISA板，4 ℃过夜；用PBST洗3次，每孔加入100 μL PBST稀释的5%脱脂乳封闭液，37 ℃封闭2 h；充分洗涤后，加入单抗腹水(按不同稀释度为1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、 1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000)，每个稀释度设置2个重复孔，以未免疫小鼠血清为阴性对照，以免疫pS273R蛋白小鼠血清为阳性对照，37 ℃ 孵育1 h，洗3次；每孔加入100 μL HRP标记山羊抗鼠IgG(1∶2 000稀释)，37 ℃孵育1 h，洗3次； 每孔加入100 μL TMB显色液，至阴性对照显色时，加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4终止液，用酶标仪测定OD450 nm值。

1.9 免疫印迹(Western blot)鉴定

以pFlag-S273R真核质粒转染293T细胞，24 h后，收集蛋白样品，或以1MOI ASFV感染PAM，不同时间点收集蛋白样品，再以常规方法进行SDS-PAGE电泳，湿转至硝酸纤维素膜(NC)。将NC膜用含5%脱脂乳的PBST溶液37 ℃封闭2 h，PBST洗3次，每次10 min；将小鼠多抗血清、单克隆抗体作为一抗，4 ℃孵育过夜后，PBST洗3次，每次10 min； 将HRP标记山羊抗鼠IgG 1∶5 000稀释作为二抗，室温孵育1 h后，PBST洗3次，利用ECL显色液显色，通过成像系统成像。

2 结 果

2.1 S273R基因重组质粒的构建

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在700～1 000 bp 可见单一扩增条带，条带大小为822 bp与预期相符。回收PCR产物，经双酶切后，与载体质粒pET-30a(+)连接，转化DH5α感受态细菌，挑取菌落，进行菌液PCR，鉴定后测序验证。测序正确的重组质粒命名为pET30-S273R。

2.2 S273R蛋白的原核表达

pET30a-S273R重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3))。挑取阳性菌落，经两种不同浓度IPTG诱导，设立未加IPTG诱导菌和空载体转化菌样本作为对照，进行SDS-PAGE电泳。结果显示：在37 ℃诱导后，继续培养6 h，S273R获得高表达。通过对菌体裂解液的上清和沉淀分析发现，该蛋白主要在包涵体中表达(图1)，蛋白大小为37 ku。

2.3 pS273R蛋白纯化SDS-PAGE分析及单抗Western blot验证

纯化后的pS273R蛋白条带较为单一，蛋白纯度达90%以上，BCA法定量蛋白浓度为1.1 mg·mL-1，满足后期免疫要求(图2)。

1. pET30-S273R未诱导上清；2. pET30a-S273R IPTG 0.5 mmol·L-1上清；3. pET30-S273R IPTG 1.0 mmol·L-1上清；4. pET30a空载体上清；M. 预染蛋白相对分子质量标准; 5. pET30-S273R未诱导沉淀；6. pET30-S273R IPTG 0.5 mmol·L-1沉淀；7. pET30-S273R IPTG 1.0 mmol·L-1沉淀；8. pET30a空载体沉淀 1. Supernatant of pET30-S273R without induction；2. Supernatant of pET30-S273R induced with 0.5 mmol·L-1 IPTG；3. Supernatant of pET30-S273R induced with 1.0 mmol·L-1IPTG；4. Supernatant of pET30a induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG；M. Protein marker；5. Precipitation of pET30-S273R without induction；6. Precipitation of pET30-S273R induced with 0.5 mmol·L-1 IPTG；7. Precipitation of pET30-S273R induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG；8. Precipitation of pET30a induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG图1 pS273R蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of pS273R protein

2.4 抗pS273R多抗血清的检测

为验证多抗的特异性，将pFlag-S273R真核质粒转染293T细胞、将SY18毒株以1 MOI感染猪肺泡巨噬细胞后分别固定，进行免疫荧光检测。IFA结果显示，小鼠多抗血清可特异性识别293T细胞中表达的pS273R蛋白，且在ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞胞质呈阳性反应(图3)。

图2 S273R蛋白纯化SDS-PAGE分析(A)及多抗血清、5A4单抗Western blot验证(B、C)Fig.2 Expression of purified S273R protein by SDS-PAGE (A) and Western blot analysis of polyclonal sera (B) or monoclonal antibody named 5A4 (C)

A. pFlag-S273R转染293T； B. 未转染的293T；C. 感染24 hpi的PAM细胞；D. 未感染的PAM细胞 A. pFlag-S273R transfected 293T; B. Untransfected 293T; C. ASFV infected PAM cells for 24 h; D. Uninfected PAM cells图3 S273R蛋白免疫荧光检测(10×)Fig.3 Immunofluorescence assay analysis of S273R protein(10×)

2.5 pS273R单抗特性检测

通过细胞融合，获得4株特异性单抗。IFA结果显示：5A4可与病毒感染和真核细胞表达产物呈阳性反应(图4)，1C12、5A3、7B9只能与真核细胞表达产物反应。Western blot结果显示：1C12、7B9可特异性识别ASFV病毒感染过程中产生的pS273R及真核细胞表达产物(图5)，而5A3、5A4仅识别真核细胞表达产物的pS273R(表1)。经ELISA效价测定，4株单抗腹水效价均达1∶64 000。

图4 5A4间接免疫荧光图片(PAM，10×)Fig.4 5A4 identification of indirect immunofluorescence assay of MAb 5A4 (PAM，10×)

图5 7B9特异性识别ASFV pS273RFig.5 7B9 specifically recognizes ASFV pS273R

3 讨 论

ASFV pS273R是一种半胱氨酸蛋白酶，在ASFV感染过程中，该蛋白酶对ASFV多聚蛋白前体pp220和pp62进行水解，分别形成p150、p37、p34、p14和p35、p15、p8。上述蛋白组成致密的核衣壳，约占整个病毒粒子25%以上[12]。当多聚蛋白不能被蛋白酶正确切割时，新组装的子代病毒粒子呈现错误包装，易丧失传染性[13]。

表1 ASFV pS273R单抗类型及免疫特性

从ASFV蛋白酶整体结构来看，蛋白酶pS273R主要由两个结构域组成：N端手臂结构域(N-ter arm domain)、C端核心结构域(core domain)。pS273R蛋白酶的N端手臂结构域是一个新结构域，且该结构域对维持蛋白酶活性具有至关重要的作用；C端结构域中则包含由催化三联体Cys-His-Asn组成的核心结构域，这部分结构特征与典型半胱氨酸类蛋白酶的结构相似[14]。

本研究进行了pS273R单克隆抗体制备并成功获得4株抗单克隆抗体，IFA结果显示：5A4可与病毒感染和真核细胞表达产物呈阳性反应，1C12、5A3、7B9只能与真核细胞表达产物反应(图3)。Western blot结果显示：1C12、7B9可特异性识别ASFV病毒感染过程中产生的pS273R及真核细胞表达产物，而5A3、5A4仅识别真核细胞表达产物的pS273R(表1)。造成这一结果的差异性可能与pS273R的空间结构和蛋白翻译后修饰有关，具体原因还需进一步分析。本试验获得的单抗为S273R功能研究奠定了基础，并为基因缺失毒的鉴定提供了生物材料。

4 结 论

成功获得ASFV S273R重组蛋白，以其制备4株单克隆抗体，并筛选出与病毒具有反应性的单克隆抗体，为ASFV S273R基因缺失毒的鉴别及S273R蛋白结构功能等基础研究提供了重要的生物材料。