云南香格里拉叉襀科昆虫病原菌的鉴定

陈健鑫，魏金龙，钱昱含*，马焕成，伍建榕1,**

(1. 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，西南林业大学生物多样性保护学院，昆明 650224；2. 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，西南林业大学林学院，昆明 650224)

昆虫纲包含近一百多万种描述物种，昆虫在生态系统中扮演着重要的角色。叉襀科Nemouroidea属襀翅目Plecoptera，是襀翅目中数量最多的一个科，叉襀科昆虫是一类重要的水生昆虫(颜忠诚和Zhong，2004)，稚虫生活在水质优良的溪流中，主要取食植物碎片，藻类、苔藓及水中小型动物，对水环境的变化较为敏感，因此常作为指示生物评估淡水环境的污染情况；其中少数种类的成虫在大量发生时，水域两边的果树也会受到一定程度的危害(Banks，1947；祝芳，2002；李卫海，2007；王洪建等，2009)。

由于外界不良环境因素的影响，昆虫种群在自然界中经常发生疾病流行，且60%以上的病原物是真菌，病原真菌长期以来一直被研究用于生物控制和综合害虫管理(IPM)策略(张维等，2020)。水霉病通常在淡水鱼类上发生，鱼类受伤后又处于恶劣的养殖环境中，容易受到丝状真菌的侵染而发生皮肤病，当病菌深入真皮及肌肉等组织，会造成鱼类组织坏死甚至死亡，魏冬梅等(2019)报道了新疆地区造成鱼类水霉病的病原菌种类有根霉属、毛霉属、水霉属、青霉属和镰刀菌属等，并通过致病性研究证实了大多数病原真菌属于机会性致病菌，与淡水鱼类的健康情况及外界环境条件有着密切的关联。

目前，对叉襀科昆虫的研究仅在分类研究阶段，对其病原菌的种类及其致病性的研究尚未见文献报道。本研究旨在通过从云南香格里拉采集的叉襀科稚虫自然病死虫体上分离病原菌，研究病原菌对叉襀科稚虫的致病性，为水生生态系统的环境监测及虫害控制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1试验材料与供试培养基

于2018年7月16日-22日在迪庆州和丽江老君山采集襀翅目稚虫及成虫。采用马铃薯琼脂固体培养基(PDA)分离病原真菌。待PDA培养基灭菌冷却至50℃时，补充30 mg/L的链霉素溶液(生工，上海)以抑制细菌的快速生长。

1.2 病原真菌分离培养

采用略改进的组织分离法分离病原真菌。方法如下：将感病叉襀科稚虫浸入75%乙醇中浸泡5 s，0.1%升汞溶液浸泡1 min，最后用无菌水漂洗5次。用无菌解剖剪将体壁剪为5 mm×5 mm的组织块并接种于PDA培养基平板，置于25℃恒温培养箱培养2～3 d。将长出的菌丝挑入新的PDA平板重复纯化3次。纯菌落接种于PDA试管斜面，菌丝长满斜面后于4℃保存。

1.3 病原真菌致病性测定

根据柯赫氏法则验证病原真菌致病性。供试病原真菌接种于PDA平板，25℃活化培养3 d，用6 mm无菌打孔器在菌落边缘打孔，挑取10个菌丝块放入无菌锥形瓶中，加入20 mL无菌水，置于摇床200 r/min震荡30 min制成孢子悬浮液，用血球计数板调节孢子液终浓度为1×105个/mL。叉襀科稚虫用无菌水漂洗5次后分别用无菌塑料杯分装(10头/组)，试验处理组分别使用30 mL孢子悬浮液培养，空白对照组使用30 mL无菌水培养。控制适宜叉襀科稚虫所需的氧气、温度、营养等条件进行饲养。每个菌株设置3个重复(细囊霉菌处理组为PN1-1、PN1-2和PN1-3；毛霉菌处理组为PN2-1、PN2-2和PN2-3以及空白对照组为CK1、CK2和CK3)，每天定时观察并记录虫体存活死亡情况。

根据饲养123 h内每日虫口死亡情况和剩余活虫数计算出累计死亡率LR123h，利用生存曲线图展现各时间段内的虫口死亡情况并通过二项式回归计算致死中时以分析菌株的致病性。

1.4 病原真菌形态学鉴定

采用玻片培养检视法观察病原菌的形态特征。方法如下：将无菌盖玻片斜插入PDA平板，在培养基上接种病原真菌，置于25℃培养7 d。将盖玻片取出后使用光学显微镜(尼康，上海)观察病原真菌营养体和繁殖体形态特征。

1.5 病原真菌分子生物学鉴定

采用真菌基因组DNA抽提试剂盒OMEGA Fungal DNA Kit(硕阳科技有公司，昆明)抽提病原真菌总DNA，提取后保存于-20℃备用。分别以两株病原真菌总DNA为模板，采用真菌18S rDNA通用引物对(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)扩增其ITS序列。PCR反应采用50 μL体系，包括2×PowerTaqPCR MasterMix(百泰克，北京)25 μL，引物(10 μmol/L)各1.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 20 μL。反应条件为94℃预变性3 min后，进行以下循环：94℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸50 s，共循环35次，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化后送华大基因测序。

利用DNAMAN 8(Wang，2015)将双向测通的序列拼接并提交到NCBI数据库进行BLAST比对。利用Clustalx 1.83对序列进行多重对比，使用BioEdit调整保守区序列。分别以Achlyacatenulate和Rhizopusoryzae作为菌株PN1和PN2的外类群，通过PAUP* 4.0b10最大简约法(Maximum-Parsimony, MP)以1 000进行Bootstrap校验，构建系统发育树分析菌株的亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 病原真菌分离培养

从云南香格里拉采集到的自然病死叉襀科稚虫上分离得到两株真菌PN1(图1-A)和PN2(图1-B)。

图1 病原真菌在PDA培养基上的培养特征 Fig.1 Morphological characteristics of pathogenic fungi on PDA media注: A, 菌株PN1; B, 菌株PN2。Note: A, strain PN1; B, strain PN2.

2.2 病原真菌致病性分析

根据柯赫氏法则验证病原真菌对叉襀科稚虫致病性，结果显示：细囊霉菌PN1处理的实验组27 h后有虫体死亡，72 h后可见死亡虫体长出菌丝，96 h后菌丝布满全部虫体(图2-A)；毛霉菌PN2处理的实验组3 h后有虫体死亡，24 h后开始长出菌丝，48 h后菌丝布满死亡虫体(图2-B)；对照组在3 h后有虫体死亡，123 h后虫体全部死亡，在实验进程中死亡虫体未长出任何菌丝。

图2 病原真菌致病性验证Fig.2 Pathogenicity assay on isolated pathogenic fungi注: A, PN1处理组; B, PN2处理组; a, 菌株PN1; b, CK; c, 菌株PN2; d, CK。Note: A, treatment group of PN1; B, treatment group of PN2; a, strain PN1; b, CK; c, strain PN2; d, CK

细囊霉菌PN1处理组27 h后初见死亡虫体，在 27～39 h死亡率突增达到46.67%，123 h后PN1-1组虫体全部死亡，7 d后PN1-2组虫体全部死亡，10 d后PN1-3组虫体全部死亡，123 h平均死亡率为93.33%；毛霉菌PN2处理组3 h后初见死亡虫体，在15～39 h死亡率突增，达到43.33%，之后死亡速率减缓，75 h后PN2-2组虫体全部死亡，99 h后PN2-3组虫体全部死亡，11 d后PN2-1组虫体才全部死亡，123 h平均死亡率为96.67%；对照组3 h后初见死亡虫体，123 h平均死亡率达到100.00%(表1，图3)。

表1 病原真菌孢子悬浮液处理123小时内稚虫的平均死虫数及平均死亡率

图3 病原真菌孢子悬浮液处理123小时内稚虫的生存曲线Fig.3 Survival curve of larvea exposed to pathogenic conidia in 123 h

通过二项式回归模型及致死中时分析比较病原真菌处理组与对照组之间的致病性差异，得出PN1及PN2处理组的死亡数量在90 h前均低于对照组，其中毛霉菌处理组PN2的死亡情况与对照组无明显差异，而细囊霉菌处理组PN1却表现出明显差异，死亡数量趋势几乎接近于线性增长。在1×105个/mL接种浓度下，细囊霉菌处理组52 h后死亡率达到50%，LT50为52.28 h，毛霉菌处理组在30 h之内死亡率达到50%，LT50为29.15 h(表2，图4)。结果表明，PN1及PN2处理组对叉襀科稚虫的致病性稍弱，其中细囊霉菌处理组PN1的致病性低于毛霉菌处理组，毛霉菌处理组PN2的致病性与对照组无明显差异。

表2 病原真菌对叉襀科稚虫致病性回归模型分析

图4 病原真菌致病性的回归模型分析Fig.4 Regression model of pathogenicity of pathogenic conidia

2.3 病原真菌形态学鉴定

菌株PN1营养体为分枝发达的丝状体，无隔膜，分体产果式。无性阶段产生游动孢子，常具有两游现象，孢子囊可由孢囊层出方式或分枝方式产生，菌丝中常形成厚垣孢子，即芽孢子，有性阶段产生卵孢子(魏景超，1990)(图5-A)。

菌株PN2菌丝生长迅速，且无假根；孢囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，单轴分枝或假单轴分枝，全部顶生孢子囊；孢子囊大，球形，含孢子甚多；孢囊孢子球形、椭圆形、卵圆形或不规则，壁薄，平滑；无附属丝(魏景超，1990)(图5-B)。

图5 PDA培养基上病原真菌形态学特征Fig.5 Morphological characteristics of pathogenic fungi on PDA media注: A, 菌株PN1; B, 菌株PN2; a, 无隔菌丝; b, 卵孢子; c, 孢囊梗; d, 孢子囊。Note: A, strain PN1; B, strain PN2; a, non-septahypha; b, oospore; c, sporangiophore; d, sporangium.

2.4 病原真菌分子生物学鉴定

通过PCR扩增得到大小约为500～750 bp特异性片段(图6)，菌株PN1和PN2的序列提交到NCBI基因库分别获得GenBank登录号：MT950235和MT950271，通过与NCBI数据库中序列比对，结果表明菌株PN1与GenBank中的细囊霉菌Leptolegniasp.同源性达到100%；菌株PN2与冻土毛霉Mucorhiemalis同源性达到99.83%，系统发育树(图7，图8)结果显示，菌株PN1与Leptolegniasp.聚为一类，支持率为100%；菌株PN2与M.hiemalis处于同一进化支，支持率为98%，从而确定了2株病原真菌的亲缘关系。

图6 病原真菌ITS序列PCR电泳结果Fig.6 PCR products of ITS sequences from pathogenic fungi

图7 菌株PN1基于ITS序列采用最大简约法构建的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of PN1 based on ITS sequences by the MP method

图8 菌株PN2基于ITS序列利用最大简约法构建的系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of PN2 based on ITS sequences by the MP method

3 结论与讨论

本研究从云南香格里拉叉襀科稚虫自然死亡虫体上分离到两株病原真菌PN1和PN2；通过形态学鉴定同时结合ITS序列进行分子生物学鉴定，确定菌株PN1为Leptolegniasp.；PN2为Mucorhiemalis；通过柯赫氏法则验证病原真菌的致病性，结果显示两株真菌对叉襀科稚虫的致病性较弱，无较强的杀虫效果。

本研究分离得到的细囊霉菌和冻土毛霉为水生弱寄生菌，属于条件致病菌，通常情况下不侵染健康的叉襀科稚虫，当外界水环境改变或被污染，不再适宜叉襀科稚虫生活，使得叉襀科稚虫处于亚健康或体壁出现伤口时，病原菌开始侵入虫体。菌丝侵入虫体的早期无明显的症状，随着病程的发展，菌丝向内穿过体壁进入肌肉组织，向外则长出絮状菌丝，最终造成稚虫死亡并加速侵染其余虫体。

Leptolegniasp.是水霉科Saprolegniaceae一种水生真菌(梁枝荣和余永年，1985；宋镇庆等，1994)，Huneycutt于1952年将该属新增至水霉科(魏景超，1990)。前人在研究中发现细囊霉属真菌对蚊科幼虫有较强的致病性，金立中(1986)年报道细囊霉属Leptolegniasp.对库蚊亚科和按蚊亚科的9种幼虫有致病作用；Andrade和Fernando(1993)曾列出一种细囊霉菌Leptolegniasp.对三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus、致倦库蚊Culexfatigans、库蚊属Culex和曼蚊属Mansonia有寄生关系；Gutierrez团队(2017)研究发现细囊霉菌Leptolegniasp.具有很高的宿主特异性，能感染蚊科幼虫，并对非目标水生生物造成伤害非常低；倪达书(1982)研究中发现当鱼类皮肤或鳃受到机械损伤及其他病原体的伤害时，鱼体抵抗力降低，水霉孢子侵入伤口并开始萌发，使鱼类发生水霉病。Bly等人(1992)通过研究沟鲶水霉病表明，当鲶鱼免疫力迅速下降才会被水霉菌感染，而健康鱼体不会感染水霉。毛霉目Mucorales是接合菌纲Zygomycetes最大的目(李钟庆，1981)。毛霉目中某些类群通常会引起动植物的病害，如甘薯在贮运过程中受到黑根霉侵染发生软腐病；李克犁头霉和微小毛霉能侵染人类的内脏器官(陈腊梅和李春阳，2007)。毛霉目感染昆虫及利用毛霉作为生防制剂防控水生害虫的研究鲜有文献报道。

叉襀科昆虫是一类重要的水生昆虫，本研究首次在叉襀科昆虫中报道了细囊霉菌和毛霉菌并分析了两株真菌对稚虫的致病性，为水生生态系统的环境监测及农林有害昆虫生物防治提供了理论依据。今后，对叉襀科昆虫病原菌种类多样性，病原菌致病条件多样性以及病原菌侵染和致病机理开展深入研究具有重大的意义。