抗凝药利伐沙班晶型的定量分析与热稳定性考察

马雨璇,王 娜,王 冰,李 钢

(南京师范大学食品与制药工程学院,分析测试中心,江苏 南京 210023)

利伐沙班的商品名为拜瑞妥,是唑烷酮类选择性Xa因子抑制剂,由德国拜耳公司和美国强生公司共同研发,是全球第一个口服的Xa因子直接抑制剂的新型药物[1-3]. 主要用于预防成人患者髋关节或膝关节置换以及非瓣膜性心房颤动术后引起的血栓形成,是抗血栓药物中目前最有前景的药物之一[4-6]. 与传统抗凝药华法林和阿哌沙班相比,利伐沙班具有可口服、受食物和药物影响较小、给药剂量可固定、出血风险低、药效学和药代动力学活性可预测、治疗窗较宽且不需要常规医疗监护等诸多优点[7-8],是目前抗凝血药研究的一个热点.

对于同一药物不同晶型的研究通常借助于 X-射线粉末衍射法(PXRD)、差示扫描量热分析法(DSC),在相关文献[9-11]中已有较多报道. 目前对利伐沙班的研究主要在药理和合成工艺方面,对晶型的报道比较少. 从文献[12-16]可知,利伐沙班存在多晶型,对药物进行晶型研究在保证药物的稳定性、提高药物的生物利用度、减少毒性和增进治疗效果等方面都具有重要意义. 本实验室主要对利伐沙班多晶型进行了制备,在制备纯晶型的过程中出现了晶型Ⅰ和Ⅱ的混晶. 对多晶型药物来说,有的晶型是有效的,有的是无效的,有的甚至是有害的,这就涉及到晶型定量分析的问题. 所以本文先利用PXRD和DSC对制备出的纯晶型和混晶进行定性分析,再通过X-射线粉末衍射法中的K值法对晶型Ⅰ和Ⅱ(药用晶型)的混晶体系进行定量分析[17],以晶型Ⅰ作为杂质确定含量,结果较为准确,为药物质量控制提供保障,最后对药用晶型Ⅱ的热稳定性进行了考察.

1 仪器与方法

1.1 仪器

天津天马衡基仪器有限公司的FA2004型电子天平;河南太康科教器材厂的SHB-3型循环水式多用真空泵;日本理学公司的D/max 2500VL/PC型阳极转靶X射线衍射仪;美国Perkin Elmer公司的Analysis Diamond 差示扫描量热仪.

1.2 材料

利伐沙班晶型Ⅰ由南京某公司提供;利伐沙班晶型Ⅱ及混晶由本实验室转晶制得.

1.3 X-射线粉末衍射法定性定量分析(PXRD)

测定条件为管压:45 kV,管流:150 mA,Cu-Kα辐射,石墨弯晶单色器,发射狭缝(DS)=防散射狭缝(SS)=1°,接受狭缝(RS)=0.15 mm. 扫描速度:10 °/min(定性分析)以及1 °/min(定量分析),步长:0.02°.

1.4 差示扫描量热法分析(DSC)

称取样品约2.0 mg放入铝坩埚中密封,将坩埚放入 DSC 中进行测试,以氮气为保护气,升温速率为 10 k/min,升温范围为 30 ℃～250 ℃,进行 DSC 分析.

1.5 X-射线粉末衍射定量分析K值法[17]

1.5.1 原理

K值法属于一种特殊的内标法,也称为基体清洗法,具有用样少,各物相互不影响且可将偶然误差降至最低限度的优点,因此被采纳用于定量分析利伐沙班晶型Ⅰ和Ⅱ混晶体系中杂质晶型Ⅰ的含量.

1.5.2 基本公式

(1)

当wj=wi时,式(1)可写为:

(2)

(3)

1.5.3 方法

在进行定量分析时,首先按1∶1比例将标样和参比物质均匀混合,经X射线衍射仪扫描后计算标样和参比物质的特征衍射峰强度,并代入式(2)求出K值(K值为常数),然后在待测样品中加入已知比例的参比物质并混合均匀,经X射线衍射仪扫描后计算标样和参比物质的特征衍射峰强度,代入式(1)和(3)即可求出待测相在原样品中的百分含量.

1.6 热稳定性考察

X射线粉末衍射仪(PXRD)及其原位高温附件(In situ high temperature). 测定条件为管压:45 kV,管流:150 mA,Cu Kα 辐射,石墨弯晶单色器,发射狭缝(DS)=防散射狭缝(SS)=1°,接受狭缝(RS)=0.15 mm. 扫描速度:10 °/min,步宽:0.02°. 真空条件下程序升温,测定了利伐沙班晶型在不同温度下晶型结构的变化. 根据热分析的结果,设定25 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、150 ℃、170 ℃、190 ℃、220 ℃这8个温度点,每个点恒温1 min,检测其结构变化.

图1 利伐沙班的PXRD图谱Fig.1 The PXRD patterns of Rivaroxaban

2 结果与讨论

2.1 X-射线粉末衍射定性分析

对得到的样品进行PXRD检测(扫描速度:10 °/min),结果如图1所示. 其中图1(a)2θ=8.9°、16.4°、19.4°、19.8°、21.6°、22.4°、25.5°和26.6°是晶型Ⅰ的特征峰,图1(b)2θ=12.7°、18.1°、19.2°、19.9°、20.8°、21.4°和25.8°是晶型Ⅱ的特征峰. 图1(c)同时出现了晶型Ⅰ和Ⅱ的特征峰,由此判定此样品为晶型Ⅰ和Ⅱ的一个混晶,并且从峰形上看以晶型Ⅰ的衍射峰为基础出现了晶型Ⅱ的特征峰. 通常对混晶进行定量分析的时候,选取没有重叠的最强峰作为特征峰,由图可知2θ=22.4°的峰可以作为杂质晶型Ⅰ定量的特征峰.

2.2 X-射线粉末衍射定量分析K值法

本实验采用α-Al2O3为参比物质. 按1∶1比例称取纯晶型Ⅰ样品和α-Al2O3配制成混合样品,置于玛瑙研钵中,研磨20 min使其充分混匀,然后取混合样品粉末适量装入样品架,将粉末样品填满样品架并压平压紧,使其表面与样品架表面齐平,制3个待测样,然后分别以1 °/min进行扫描检测. 衍射图谱见图2,取2θ=35.1°处峰为参比物质α-Al2O3的特征峰,2θ=22.4°处峰为晶型Ⅰ的特征峰,并将峰面积积分强度数据代入式(1)、(2)中进行K值的计算,取3次计算结果的平均值作为K值. 本方法测得晶型Ⅰ的K值为1.17. 计算结果见表1.

将未知含量的混晶样品与α-Al2O3按2:1比例称取,按上述方法制备3个待测样品,以相同实验条件进行PXRD检测,衍射图见图3,将衍射峰强度数据代入式(1)和(3)即可求得未知含量混晶样品中晶型Ⅰ的百分含量及质量. 晶型Ⅰ在被测物质中含量为40.37%,在原混晶样品中的含量为60.55%. 检测结果见表2.

图2 α-Al2O3和利伐沙班晶型Ⅰ混合样品的PXRD图谱Fig.2 The PXRD patterns of α-Al2O3 and Rivaroxaban form Ⅰ

图3 α-Al2O3和利伐沙班晶型Ⅰ含量的PXRD图谱Fig.3 The PXRD patterns of α-Al2O3 and Rivaroxaban form Ⅰ content

表2 利伐沙班晶型Ⅰ含量的结果Table 2 The result of Rivaroxaban form Ⅰ content

表1 K值的结果Table 1 The result of K-value

表3 利伐沙班晶型Ⅰ含量的验证结果Table 3 Results of the verification of Rivaroxaban form Ⅰ content

为了考察K值法对利伐沙班混晶定量分析的准确性,进行了验证实验. 取上一步的试样加入纯晶型Ⅰ,使未知含量的混晶样品、α-Al2O3和纯晶型Ⅰ的比例为2∶1∶1,研磨20 min使之充分混匀,制成3个待测样,以相同实验条件检测,衍射图见图4,将衍射峰强度数据代入式(1)得到实际被测物质中晶型Ⅰ的平均百分含量55.17%,结果见表3. 与理论值55.28%进行对比,相对偏差为0.20%. 结果表明,本方法快速准确,简单实用,可用于工厂的大批量分析工作.

2.3 差示扫描量热法分析(DSC)

取样品进行DSC分析,结果如图5所示(图中标明的温度为峰顶温度,并非起始温度). 图5(a)晶型Ⅰ只有一个吸热峰,测量得到熔点和热晗分别为232.7 ℃和117.8 J/g;图5(b)晶型Ⅱ在197.6 ℃有一个弱的放热峰,测量得到热晗为-10.5 J/g,在231.8 ℃有一个吸热峰,测量得到热晗为101.7 J/g,该吸热峰与晶型Ⅰ基本一致,推断197.6 ℃的放热峰为晶型Ⅱ由亚稳晶型转变为稳定的晶型Ⅰ,因此具有与晶型Ⅰ大致相同的熔点. 图5(c)是混晶Ⅰ和Ⅱ的曲线,由此可见在189.1 ℃有一个放热峰,热晗为-7.5 J/g,与图5(b)相比降低了8.5 ℃,这是因为含有晶型Ⅰ所导致,在232.1 ℃有一个热晗为112.8 J/g的吸热峰,3条曲线熔点峰一致,证明晶型Ⅱ最终转变为晶型Ⅰ.

图5 利伐沙班的DSC曲线Fig.5 DSC curve of Rivaroxaban

图4 加标回收实验的PXRD图谱Fig.4 The PXRD patterns of the standard added recovery experiment

图6 利伐沙班晶型Ⅱ的变温图谱Fig.6 XRD patterns of Rivaroxaban form-Ⅱ at various temperature

2.4 热稳定性分析

从图6可以看出,利伐沙班晶型Ⅱ在25 ℃～170 ℃之间晶型是稳定的,没有发生任何改变,与DSC分析结果相同. 在190 ℃时,晶型Ⅱ的两个特征峰(2θ为12.7°和20.8°)强度减弱,开始出现晶型Ⅰ的特征峰(2θ为8.9°和25.5°),并且在22.3°处的峰强度明显增加,整个衍射峰由纯晶型Ⅱ变成晶型Ⅰ和Ⅱ的混晶. 这与图5(b)中晶型Ⅱ在190 ℃出现朝下的尖锐放热峰结果一致. 在220 ℃时晶型Ⅱ的特征峰完全消失,晶型Ⅰ的特征峰强度明显变大,整个衍射峰由混晶变为纯晶型Ⅰ,这与图5中晶型Ⅱ具有与晶型Ⅰ相同的熔点结果一致.

3 结论

在制备纯晶型的过程中,除了本文定量分析的最常出现的晶型Ⅰ和Ⅱ混晶外,还有晶型Ⅰ、Ⅳ和Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的混晶. 3种混晶样品在常温放置一段时间后,都会发生晶型的转变. 晶型Ⅰ和Ⅱ混晶在一段时间之后,晶型Ⅰ的衍射峰强增加,晶型Ⅱ的峰强降低,亚稳定晶型Ⅱ逐渐向稳定晶型Ⅰ转变. 晶型Ⅰ和Ⅳ混晶晶型在一段时间之后,晶型Ⅳ的特征峰消失,变成了纯晶型Ⅰ. 晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的混晶在一段时间后,晶型Ⅳ特征峰消失,晶型Ⅱ峰强降低,晶型Ⅰ峰强增加,变成了晶型Ⅰ和Ⅱ的混晶. 所以本文只对晶型Ⅰ和Ⅱ混晶进行了定量分析.

本文20 min的研磨除了会使晶型强度降低以外,对定量分析没有影响. 但是过度的研磨以及过量的研磨时间对定量分析有没有影响,需要进一步考察.