3种检测方法在儿童活动性结核病诊断中的应用*

杨 硕，李贵霞，李文辉，郭映辉，黄 慧，张文超，王 乐△

河北医科大学附属河北省儿童医院：1.儿科研究所；2.检验科；3.感染科，河北石家庄 050031

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2014年7月至2019年3月于本院就诊的疑似结核病患儿病例资料并筛选。本研究获得本院医学伦理委员会批准。活动性结核病组(结核病组)纳入标准：细菌学确诊患儿体液标本抗酸染色阳性或血液结核菌培养阳性；临床诊断的活动性结核病患儿存在疑似活动性结核病症状，影像学检查提示存在活动性结核病，抗结核治疗有效[7]。非结核病组为经临床诊断排除结核感染的其他疾病患儿。排除标准：(1)入院前已接受抗结核治疗；(2)使用免疫抑制剂或糖皮质激素治疗>1周[8]；(3)人类免疫缺陷病毒(HIV)感染；(4)未同时采用IGRA、TST两种方法检测；(5)临床信息不全或诊断不明确。符合以上任一项即可排除。

最终纳入患儿367例，年龄0～15岁，结核病组113例，非结核病组254例。结核病组中，男73例，女40例；年龄1个月至<16岁，0～<2岁15例，2～<6岁37例，6～<10岁32例，10～15岁29例；肺结核100例(88.5%)，肺结核合并肺外结核5例(4.4%)，肺外结核8例(7.1%)。非结核病组中，男159例，女95例；年龄1个月至<16岁，0～<2岁57例，2～<6岁85例，6～<10岁67例，10～15岁45例。

1.2检测方法

1.2.1IGRA 入院或就诊当天以肝素抗凝管采集患儿静脉外周血2～4 mL，室温6 h内分离单个核细胞，采用英国Oxford Immunotec公司生产的结核感染T细胞免疫斑点试验(T-SPOT.TB)试剂盒检测，具体操作参照试剂盒说明书。结果判断：当阴性对照孔斑点数为0～5时，CFP-10和ESAT-6抗原检测孔任一孔计数-阴性孔计数≥6判为阳性；当阴性对照孔斑点数为≥6时，检测孔计数>2倍阴性孔斑点数方可判断为阳性；阳性对照孔斑点数≥20，检测孔计数均达不到阳性标准时则判断为阴性。

1.2.2TST 入院或就诊当天于患儿前臂1/3皮肤无瘢痕部位皮下注射0.1 mL结核菌素纯蛋白衍化物(5 IU)，48～72 h后观察反应情况并测量硬结平均直径(mm)。结果判断：硬结平均直径<5 mm或无反应为阴性(-)；5～<10 mm为阳性(+)；10～<20 mm为中度阳性(++)；≥20 mm为强阳性(+++)；除硬结外有水疱、破溃及双圈反应为极强阳性(++++)。

1.2.3TB-Ab检测 入院或就诊当天以分离胶促凝管采集患儿静脉外周血2 mL，48 h内分离血清，使用南京大渊生物技术工程有限公司生产的结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒(蛋白芯片法)及PBT-X4型生物芯片识别仪检测，具体操作参照试剂盒说明书。结果判断：脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、结核菌重组蛋白抗原16×103和38×103IgG抗体，若其中任何一种抗体为阳性，则判断该标本结核分枝杆菌抗体阳性；若3种抗体检测均为阴性，则结果判定为阴性。

1.3评价指标 临床最终诊断为“金标准”，分析参数包括灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比、约登指数、一致性及受试者工作特征曲线下面积(AUC)等。

1.4统计学处理 采用SPSS24.0软件进行数据处理及统计分析，计数资料以频数或百分率表示，采用McNemar检验，以P<0.05为差异有统计学意义。一致性采用一致性检验，以Kappa值表示，Kappa>0.75表示一致性高；Kappa=0.40～0.75表示一致性中等；Kappa<0.40表示一致性差。

2 结 果

2.13种检测方法的参数分析 3种方法中IGRA灵敏度(90.1%)最高，TB-Ab检测最低(7.9%)；TB-Ab检测特异度(98.6%)最高，TST最低(83.5%)。IGRA的阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、约登指数和AUC均高于TST及TB-Ab检测；IGRA的阴性似然比均低于TST和TB-Ab检测。

植物园中的盆栽桂花、银边翠、时令蔬菜，质量分数为4.2%的碳酸氢钠溶液、质量分数为25%的氢氧化钠溶液、质量分数为0.1%的碘液。

IGRA与临床诊断结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，TST和TB-Ab检测与临床诊断结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。IGRA在三者中具有较高的临床诊断一致性(Kappa=0.800)。见表1。

2.2IGRA与TST在各年龄组的参数分析 IGRA在4个年龄组患儿中，6～<10岁组灵敏度(96.9%)最高，0～<2岁组特异度(96.5%)最高。与临床诊断比较，2～<6岁组一致性最高；6～<10岁组一致性中等，与临床诊断结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

TST在4个年龄组患儿中，6～<10岁组灵敏度(90.6%)最高，10～15岁组特异度(86.7%)最高。与临床诊断结果比较，4个组一致性中等；0～<2岁组TST结果与临床诊断结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

在4个年龄组患儿中，0～<2岁组IGRA的灵敏度与TST相等，其他年龄组IGRA灵敏度均高于TST；6～<10岁组IGRA特异度及阳性预测值均低于TST，其他3组IGRA特异度及阳性预测值均高于TST。IGRA在各年龄组的阳性似然比、阴性预测值、约登指数、AUC和Kappa值均高于TST，阴性似然比均低于TST，见表2。

表1 3种检测方法的参数分析

表2 各年龄组IGRA和TST的参数分析

2.3联合检测 当IGRA与TST联合检测时，结核病组中共有109份标本结果为阳性，联合检测的灵敏度为96.46%。

3 讨 论

2018年，全球接受结核病预防性治疗的5岁以下患儿占估计符合纳入治疗条件的130万例的27%[1]，加强儿童结核病和潜伏结核感染(LTBI)诊断是控制结核病传播的重要手段。细菌学检查是结核病诊断的“金标准”，但患儿的涂片阳性率一般为0%～15%，培养阳性率低于30%～40%，这与患儿排菌量低且标本留取困难、结核菌培养条件苛刻等因素有关[9-10]。因此，传统的病原菌检测方法并非儿童结核病诊断的首选。本研究针对结核病患儿评价3种常用免疫学方法的诊断价值，并评估不同年龄阶段患儿中IGRA与TST的应用价值。TB-Ab检测在本研究第一阶段中与临床诊断结果一致性低，故不在亚组中进一步分析。

T-SPOT.TB是通过检测结核特异的效应T细胞所分泌的γ-干扰素来判断受试者是否存在结核菌感染。机体感染结核菌后，可形成结核特异性记忆型T细胞在体内长期存在，当免疫细胞再次受到抗原刺激时，记忆T细胞迅速活化增殖释放γ-干扰素。试剂采用两种结核特异抗原(ESAT-6、CFP 10)，其与卡介苗(BCG)和多数非结核分枝杆菌(NTM)不发生交叉反应[11]，所以特异度高，适合用于BCG接种率较高的地区[12]。此外，由于可同时检测CD4+及CD8+T细胞，所以其灵敏度受免疫力情况影响小。PLANA等[13]研究发现，即使在患有血液病的免疫抑制结核病患者中，IGRA可达到44.2%的阳性率，明显高于TST(17.4%)。本研究结果显示，IGRA结果与临床诊断结果一致性高，提示该方法对诊断儿童活动性结核病的应用价值较高，与孙琳等[5]和鲍磊等[14]研究结果一致。LTBI是人体受到结核分枝杆菌刺激后出现持续免疫反应但没有活动性结核病临床证据的一种状态，其隐匿性强，早期难被发现。AHMED等[15]认为，LTBI儿童1年内约有15%～43%可发展为结核病，IGRA对于<15岁LTBI患儿具有较高的特异度和阳性预测值。因此，临床诊疗时对于此类IGRA检测阳性而无临床症状病例应当高度重视，评估是否为LTBI患儿，并进行及早干预。

TST是临床常用的检测结核菌感染的技术手段之一，利用结核菌素蛋白衍生物可刺激机体产生免疫反应。TST阳性结果不能排除BCG接种反应与NTM感染，而阴性结果亦不能排除结核病的可能[7]。我国新生儿BCG接种率较高，在一定程度上影响了试验的准确度。本研究中TST灵敏度77.9%，特异度83.5%，与临床诊断结果比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。临床应用中常通过提高TST的阳性标准以提高其特异度，但相应会使其灵敏度降低，增加了漏诊的可能性。国家结核病规划指南推荐对免疫抑制儿童或5岁以下的结核病密切接触儿童以TST结果>5 mm作为阳性诊断标准，其他儿童以>10 mm作为阳性诊断标准，以此来提高试验的准确性[16]。

TB-Ab检测的结核蛋白芯片技术是利用微阵列技术将纯化的结核菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)、蛋白16×103及蛋白38×1033种抗原固相于同一微孔滤膜上，与血清中抗体进行快速凝集反应，并利用免疫金作为标记物直接在膜上显色。而结核分枝杆菌为胞内寄生菌，机体的抗结核免疫主要依赖于特异性的细胞免疫。本研究结果显示，TB-Ab检测的AUC仅为0.533，远远低于成人的数据[17],不能满足临床诊断需要。分析认为儿童免疫系统尚不成熟，血清中未产生足够抗体，从而直接影响了检测结果。有研究认为血清结核抗体反应差异较大可能还与地理环境、结核菌基因型及抗原特异性等多种因素相关[18-19]，因此该方法诊断价值还需进一步研究验证。

本研究发现，IGRA在6～<10岁组中特异度较低，分析认为可能是由于IGRA阳性结果不能排除LTBI，而目前对诊断LTBI没有明确的“金标准”，临床诊断不能准确鉴别患儿是否为LTBI而造成的。有Meta分析结果发现，IGRA对结核病患儿检测的灵敏度可高于临床诊断结果[20]。TST在0～<2岁组中特异度低，分析认为低龄儿童BCG接种时间间隔短，机体记忆性保护作用仍较强，对TST产生了较多的交叉反应，从而影响试验结果。既往研究发现，BCG保护作用可持续10年左右，且随着年龄增长其保护作用逐渐减弱[21-22]，这与本研究中10～15岁组TST的灵敏度下降而特异度升高的结果相符。

IGRA结果在4个年龄组中约登指数及Kappa值均高于TST，表明其在各年龄组的诊断价值均优于TST。而0～<2岁组和2～<6岁组中IGRA结果与临床诊断结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，显示其在低年龄段组患儿中也具有良好的应用价值。

由于结核病患儿细菌学检查结果阳性率低，本研究主要以临床诊断为“金标准”评估3种检测方法的诊断价值，且不能排除LTBI的情况，研究结果可能存在一定的偏倚，因此采用较严格的入组筛选标准。

本研究结果发现，相比TST与TB-Ab检测，IGRA可以更有效地辅助临床对儿童结核病进行早期诊断，具有较高的应用价值。而TST因操作简便快速，作为临床广泛应用的筛查手段仍具有重要的检测价值。联合使用IGRA及TST可以更好地提高各年龄段儿童结核病的诊断灵敏度，有助于对结核病患儿的及早发现，及早干预，减少其严重并发症及后遗症发生。