匍茎百合的细胞地理学分析

苏丹美，李 娟，郭先林，何兴金，周颂东

(四川大学 生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610064)

匍茎百合(Liliumlankongense)隶属于百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)，是中国的一个特有百合物种，主要分布于西藏东南部、云南西北部等地，多年生草本植物，花被片反卷，花粉红色且有深红色斑点[1]。匍茎百合不仅具有花型优美，具芳香味等较高的观赏价值，而且由于对亚洲百合杂种系最重要的疾病——葡萄孢疫病具有高度的抗性，被认为是百合园艺品种杂交育种的良好材料[2-5]。近年来，对于匍茎百合的研究主要集中在个别居群的花粉、叶表皮形态、核型和分子系统学[6-10]等方面。

细胞地理学是一门研究染色体的特性及其与植物地理分布之间关系的学科[11]。染色体作为基因的载体，在植物地理分布中具有特殊的重要性，因此细胞地理学也被称作染色体地理学[12]。核型是体细胞染色体数目、大小、形状和缢痕相对位置等形态结构的表现[13]，在同一物种不同自然居群间和近缘物种间，可能存在差异，从而导致物种变异或进化。因此，核型可作为推测物种进化途径、扩散路线和亲缘关系的细胞学依据[14-16]，在细胞地理学研究中具有特殊意义[13]。已有许多学者借助种内不同居群的核型探讨了物种的种类分化等问题，如长花马先蒿、康滇假合头菊、泸定百合、七筋姑和玉竹[17-21]等，而匍茎百合大多数居群仍缺乏细胞学资料。本研究在匍茎百合各个分布区收集了代表居群8个并希望结合前人报道，对匍茎百合核型数据分析，从细胞地理学方面揭示匍茎百合种内演化趋势。

1 材料和方法

1.1 实验材料

基于匍茎百合的标本记录，于2018 ～ 2019年在西藏自治区、云南省和四川省野外共收集了匍茎百合8个居群的实验材料。匍茎百合狭域分布于横断山区，在西藏自治区、四川省分别收集了1个居群，在云南省共收集了6个居群。将各居群个体鳞茎分别保存并移栽到花盆中，置于本实验室的培养室。材料来源及凭证标本保存于四川大学植物标本馆SZ(表1)。

表1 匍茎百合8个居群的细胞学材料来源

1.2 实验方法

待野外采回的鳞茎根尖长至2 ～ 3 cm时，取幼嫩根尖作为实验材料。具体做法如下：1)上午8：00 ～ 9：00切取根尖1 ～ 2 cm，加入0.1%秋水仙素水溶液与饱和对二氯苯水溶液1∶1混合液于黑暗环境中预处理9 ～ 11 h；2)置于现配的卡诺氏固定液(冰乙酸∶无水乙醇=1∶3)中于4 ℃冰箱中固定过夜；3)转入至70%乙醇中，置4 ℃冰箱内保存备用；4)1 mol/L盐酸(60 ℃恒温水浴)解离12 ～ 15 min；5)改良苯酚品红染液静置染色12 min；6)常规压片，镜检。选择分裂相良好的中期细胞在100倍油镜下拍照。染色体计数按Levan等[22]方法。每个居群至少取5个分散较好的细胞染色体测量其核型参数。随体计算在染色体长度之内，以一个居群内观察到的最高随体数目作为该居群随体个数[23]。核型分析和命名采用Levan等[22]方法，核型不对称性采用Stebbins[24]处理方式。此外，也用Arano[25]提出的不对称系数As.K%来评估核型不对称性，As.K%值越高，核型越不对称。核型数据测量和处理采用软件MAML 1.0[26]并辅之以手动调整。

2 结果与分析

在本研究中，匍茎百合察隅居群、书松村居群、茨中村居群、兰坪居群、维西居群、木里居群核型为首次报道，首次发现匍茎百合中存在B染色体。匍茎百合细胞核型比较结果见表2，随体染色体(satellite chromosome)在核型公式中简写为SAT。各居群染色体形态和核型图见图版Ⅰ和图版Ⅱ、核型模式图见图版Ⅲ。

图版Ⅰ 匍茎百合不同居群染色体形态和核型图A、A′. 察隅居群；B、B′. 茨中村居群；C、C′.书松村居群；D、D′. 贡山居群。箭头所指表示次缢痕位置，标尺长度10 μmPlate Ⅰ Morphology and karyotype of somatic chromosomes of L. lankongense in different populationsA,A′. Zayü population; B,B′. Cizhong population; C,C′. Shusong population; D,D′. Gongshan population. Black arrows show the secondary constrictions. Scale bar indicating 10 μm

实验结果表明，8个居群的染色体基数均为x = 12，为二倍体，染色体数目为2n = 2x = 24(表2)。染色体类型包含m、sm、st和t等4种，核型均属于Stebbins[24]的3B型。不对称系数As.K%介于81.28% ～ 83.53%，差异较小，察隅居群为最低，木里居群为最高，核型不对称性强。除了书松村居群臂比值大于2的染色体占全部染色体数的百分比为87.50%外，其他7个居群的百分比均为83.33%。察隅居群、茨中村居群、书松村居群、贡山居群、兰坪居群、丽江居群、维西居群、木里居群的最长与最短染色体相对长度比值分别为2.18、2.31、2.27、2.18、2.18、2.18、2.19以及2.22，可见除了茨中村居群、书松村居群、木里居群数值稍大外，其他居群最长与最短染色体相对长度比值都接近。8个居群中，2个居群(木里居群和书松村居群)有B染色体；5个居群(察隅居群、茨中村居群、兰坪居群、维西居群、丽江居群)有随体，包括居间随体、短臂随体和长臂随体，随体数目为1 ～ 3(表2，图版 Ⅲ)。

从核型公式来看(表2)，匍茎百合8个居群的染色体组成可以分为两大类：一是染色体类型只包括m、st和t三种，如察隅居群、茨中村居群和木里居群；二是染色体包含m、sm、st和t四种类型，如书松村居群、贡山居群、兰坪居群、丽江居群、维西居群。具备第一类(没有sm染色体)组成核型的3个居群，其地理分布点几乎位于同一弧线上(图1)，并且第1对和第2对染色体类型均是m。染色体类型多样性呈现出察隅居群、茨中村居群和木里居群这一弧线居群小于这一弧线上纬度向南、向北。

如表2所示，不对称系数As.K%从小到大排列为：察隅居群(81.28%)、丽江居群(82.07%)、茨中村居群(82.16%)、兰坪居群(82.25%)、维西居群(82.33%)、贡山居群(82.38%)、书松村居群(82.77%)，木里居群(83.53%)，核型不对称系数整体上表现为从西到东递增。如表2，图版 Ⅲ所示，第3对和第10对染色体上多具有随体。在核型的随体特征方面，察隅县居群在第1对和第10对染色体分别有1条具有短臂随体和长臂随体；茨中村居群和维西居群第3对具有居间随体，第10对染色体有1条具有长臂随体；兰坪居群第3对染色体具有居间随体，第10对染色体其中1条有居间随体；丽江居群第3对和第10对染色体各有1条居间随体。不同居群间随体数量和位置存在差异，随着从西到东的地理分布，居间随体增加，随体数量增加。

图版Ⅲ 匍茎百合8个居群的核型模式图A. 察隅居群；B. 茨中村居群；C.书松村居群；D.贡山居群；E.兰坪居群；F.丽江居群；G.维西居群；H.木里居群Plate Ⅲ Idiograms of 8 populations of L. lankongenseA. Zayü population; B. Cizhong population; C. Shusong population; D. Gongshan population; E.Lanping population; F. Lijiang population; G. Weixi population; H. Muli population

表2 匍茎百合8居群核型参数比较

从染色体类型、核型不对称系数以及随体类型分析，匍茎百合核型整体表现为察隅县-茨中村-木里县这一条线县居群染色体类型多样性小于这一条线上向北、向南分布居群染色体多样性，从西到东地理居群核型不对称系数以及随体类型呈现出由西向东增强趋势，匍茎百合可能的扩散方式如图1所示。

箭头表示匍茎百合可能的扩散方向

3 讨 论

周颂东[7]于2008年报道了匍茎百合云南香格里拉纳帕草原居群(以下简称：纳帕草原居群)，核型公式为2n=2x=24=4m+10st(6SAT)+10t，核型不对称系数为80%，最长染色体/最短染色体比例为1.96，臂比大于2的染色体比例为83%，核型类型为3A型，第3、6和9对染色体都具有随体。本研究采集的8个居群和周颂东报道的纳帕草原居群(共9个居群，分布点见图1)几乎涵盖了匍茎百合所有的分布点，能基本反映匍茎百合染色体特性与地理分布之间的联系。

百合族的核型同源染色体的杂合性主要是由于染色体的结构变异。染色体结构变异包括染色体的不等长易位、缺失，以及染色体非相互易位、臂间或臂内倒位，前者可引起同源染色体长度不等，后者可引起同源染色体长度、类型和次缢痕差异[7]。在本研究中匍茎百合的同源染色体表现出长度不等，配对差，有无次缢痕，或是组成同源染色体的染色体类型不同等结构变异，这些变异现象在百合族植物中都有发现[7]。染色体的结构变异是百合属种内分化的基础，外部表现形式为次缢痕。次缢痕的进化趋势如下：细胞核型中无次缢痕的种类是较原始的，具次缢痕和次缢痕多的种类是进化的；端部随体较居间随体原始[7]。匍茎百合的纳帕草原居群的第3对、第6对、第9对具有较进化的居间随体[8]，在随体的数量和类型上纳帕草原居群也符合表2中8个居群呈现出的随着从西到东的地理分布，随体数量增加，居间随体增加。因此从随体方面，匍茎百合在核型上(即不同居群的随体染色体不同)染色体表现出自西到东演化的趋势。

染色体核型不对称是细胞地理学研究中的重要量化指标[17]，但Paszko[27]认为仅用Stebbins提出的核型不对称性是很难准确反映染色体的不对称性。本研究结合核型类型和Arano[25]提出的核型不对称系数，基于3项原则(百合族核型的演化由3A←3B→3C[7]；染色体核型由对称性向不对称性演化[28]；核型不对称系数值越高，核型越不对称[25])分析纳帕草原居群的染色体的不对称性。纳帕草原居群[8]的核型不对称系数偏低，但核型为3A型，随体数量和类型多，因此认为纳帕草原居群是较为进化的居群。

此外，从核型的类型来看，匍茎百合的核型类型可以分为两类，类型1的染色体组成只有m、st和t三种，如察隅县-茨中村县-木里县这一弧线上的4个居群(纳帕草原居群、察隅居群、茨中村居群、木里居群)。类型2的染色体组成有m、sm、st和t四种，多了sm染色体，存在于其他的5个居群。类型1的第一对和第二对染色体均为m，第二对染色体的形态并不完全一致，其中一条的染色体着丝粒较另一条更靠近中部，短臂长度有些许差异。而类型2的第二对染色体着丝粒位置较为接近，为近中部着丝粒。Stebbins[24]认为m染色体向sm染色体的进化时，至少要发生染色间不等罗伯逊易位、同一染色体臂间不等倒位或染色体内转化，这是染色体结构变异的表现。因此类型1的第二对m染色体间短臂染色体可能发生不等罗伯逊易位，进化为类型2的sm染色体，可以推测察隅居群、茨中村居群、纳帕草原居群和木里居群这一条线上与从这一条水平线上分别向北和南方向的居群相比，更为原始。综合次缢痕、核型不对称系数和染色体组成等数据，揭示了匍茎百合各居群在地理分布上沿着察隅县-茨中村-香格里拉市-木里县这一条线从西到东的迁移、扩散的分布过程中，其对应分布的地理居群的核型也呈现出由西向东的不对称性增强、由相对原始到相对进化的演化趋势。同时分布于贡山县至香格里拉市一线的居群在地理分布上还存在纬度上的向北和向南迁移、扩散的分布扩张态势，其对应分布的地理居群的核型呈现出由贡山县至香格里拉市一线向北和向南分布的居群核型不对称性增加、由相对原始至相对进化的演化趋势(图1)。

在匍茎百合的9个居群中，只在书松村居群和木里居群中发现B染色体。B染色体的存在有利于个体和居群在极端条件下存活[29]。书松村居群和木里居群的生境是树林边缘的峭壁上，与其他居群的松树林下和草坡相比，环境相对恶劣，并且周围环境能发现的个体较少，不似其他居群的个体繁多。因此，B染色体虽然不能作为种级和种下等级的划分依据，但对特殊环境的适应方面具有十分重要的意义，可以为匍茎百合向外扩大生存空间时，克服特殊生境带来的向外扩张方面的环境因子障碍，这充分表明特产中国青藏高原的匍茎百合是一个正处于高度分化过程中的物种。