羌活与宽叶羌活的群体遗传结构和种间分化研究

洒 威，周 通，关天霞，尚千涵，尹 卫，田 凤，李忠虎*

(1 青海大学 生态环境工程学院，省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016；2 西北大学 生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，西安 710069；3 青海省科学技术信息研究所有限公司，西宁 810001)

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，一般指种内遗传多样性，或称遗传变异，是生物体内遗传物质发生改变，并能稳定遗传的一种变异，正是由于这种变异存在使得生物体在不同水平上具有多样性[1-2]。影响物种遗传多样性的因素，包括物种的繁育系统、自然选择、基因流，以及由于环境变化和人为因素干扰引起的种群隔离、生境破碎化等[3-4]。对物种遗传多样性的研究可以揭示物种或种群的进化历史，预测其进化趋势和未来命运[5]。

植物通常以种群作为进化的基本单位，衡量其遗传多样性除了要考虑种群遗传变异性的高低，还要探究其遗传分布模式，即遗传结构。一般来说，濒危物种的种群具有片段化分布的特征，生境的异质性与遗传结构的形成尤为密切，研究物种不同自然地理分布区域的遗传变异式样，有助于深入探究物种稀有或濒危的原因及过程[1]。分子标记技术是研究遗传变异和遗传结构的主要手段，其中简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)[6]是以1～6个核苷酸为基本重复单位的一段DNA串联重复序列，普遍存在于真核生物基因组中。鉴于SSR标记操作简单、呈共显性遗传，并且重复单位的重复次数在个体间高度变异且数量丰富，能揭示更高程度的多态性，近年来已广泛应用于模式植物如大豆、水稻、玉米等植物遗传图谱构建、基因定位及遗传多样性等研究领域[7-8]。

羌活(Notopterygiumincisum)与宽叶羌活(Notopterygiumfranchetii)，隶属于伞形科羌活属，是中国特有的珍稀濒危药用植物[9]，主要生长在四川、云南、西藏、陕西等省的山区，海拔高度范围在1 700～5 000 m。在自然界，羌活属植物种子萌发力弱，生长速度缓慢，目前尚无完善的人工驯化种植机制，难以实现规模化栽培。近年来，价格和需求等因素促使人们对野生植物资源掠夺式采挖，如今羌活在最适生长区域已呈濒危状态，现有资源分布区域的生态环境极为恶劣，不利于种群更新和繁衍[10]。为了有效保护羌活属植物的野生资源，了解其濒危机制，亟需对其遗传变异组成、遗传结构和种间分化模式进行研究。但目前国内外对羌活属植物的研究仅局限于种子萌发[11]、系统分类[12]、化学成分分析[13]、药理作用、人工育苗技术[14]、群落与环境的关系[15]等方面，从DNA分子水平上对羌活种群的研究相对缺乏，且针对羌活保护生物学的研究还不完善。本研究利用SSR标记对羌活与宽叶羌活邻域及异域分布的自然种群进行研究，探索物种遗传多样性的地理分布和遗传结构的空间模式，揭示两物种间基因交流的大小以及物种分化程度，为两种珍稀植物资源的合理利用和科学保护提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 植物材料采集

本研究于陕西、甘肃、青海和四川4个省份，选择羌活与宽叶羌活共23个种群的227个个体作为研究对象，其中羌活13个种群132个个体，宽叶羌活10个种群95个个体。将采集的新鲜嫩叶存放于自封袋中，用硅胶干燥，室温保存，同时详细记录每个采样地点的海拔和经纬度等信息(表1，图1)。

蓝色圆圈代表宽叶羌活，黄色圆圈代表羌活

表1 羌活和宽叶羌活野外采样信息表

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取和引物筛选取硅胶干燥的植物叶片，使用改进的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取羌活和宽叶羌活的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，观察并拍照记录电泳结果。利用30对多态性较高的SSR引物对检测合格的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，经过温度梯度和多态性筛选能够在羌活和宽叶羌活中成功扩增并具有多态性的特异性引物(表2)。

表2 微卫星引物信息表

1.2.2 PCR扩增及其产物检测本研究选择了12对多态性的微卫星标记引物，对羌活和宽叶羌活的所有采样个体进行PCR扩增。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，然后进行36次循环： 94 ℃变性30 s，54～58 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min；最后72℃延伸7 min，10 ℃保存。PCR反应体系为：10 μL反应溶液中包含Mix 5 μL、双蒸馏水3.4 μL、模板DNA 1 μL、上游引物和下游引物各0.3 μL。PCR扩增产物放置于4 ℃冰箱储存。随后用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增目的条带，用1%硝酸银溶液进行染色，再用氢氧化钠溶液和甲醛溶液显影，放入成像仪中观察并拍照记录试验结果。最后对所有引物进行荧光标记，重新对所有取样个体进行PCR实验，然后对扩增得到的PCR产物利用毛细管电泳的方法进行基因分型分析。

1.3 数据分析

使用Genemaker软件读取每个SSR标记主峰的分子量大小，记录分析所得数据。同时利用Genemaker软件统计群体遗传多样性参数，包括等位基因数目(Na和Ne)、基因杂合度(Ho和He)和多态性信息含量(I)等，以及可以反映群体遗传分化程度的参数，包括近交系数(Fis)和基因流(Nm)等。Arlequin软件进行分子方差分析(AMOVA)用于统计遗传变异情况，同时计算物种间和群体间遗传分化系数(Fst)。此外，基于Structure软件分析确定样本的聚类分组，分析种群遗传结构；同时使用GenAlx软件进行主坐标分析(principal component analysis,PCoA)研究各个种群间的遗传相似性和遗传关系。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性

12对SSR引物检测23个种群227个样本的遗传多样性参数计算结果见表3和表4。在羌活群体中，检测到平均等位基因数目(Na)和有效等位基因数(Ne)的变化范围分别为2.000～3.333和1.369～2.324，平均值分别为2.603和1.777；期望杂合度(He)在0.198～0.472之间，平均值为0.313；观测杂合度(Ho)在0.145～0.420之间，平均值为0.308；多态性信息指数(I)在0.358～0.864之间，平均值为0.566。在宽叶羌活群体中，检测到Na和Ne的变化范围分别为2.000～2.583和1.524～1.857，平均值分别为2.200和1.641；He在0.222～0.366之间，平均值为0.308；Ho在0.242～0.400之间，平均值为0.320；多态性信息指数在0.385～0.611之间，平均值为0.508。以上遗传学参数说明2个物种具有中等水平的遗传多样性，各自种群间等位基因数目差异不大，但羌活种群的杂合度变化范围较大，种群间的杂合子数目差异明显(图2)。

M表示DNA分子量标准；1～30代表不同的取样个体

表3 羌活和宽叶羌活23个种群的遗传多样性分析

近交系数(Fis)值越接近于零，则基因型分布越接近于平衡状态，Fis>0说明杂合子缺失，Fis<0说明杂合子过剩[16]。羌活与宽叶羌活群体近交系数(Fis)平均值分别为0.034和-0.051，表明羌活和宽叶羌活群体整体基因型表现为杂合子过剩，种群内存在较多的杂交和远交现象。此外，羌活和宽叶羌活的基因流(Nm)分别为1.211和1.118，说明群体间存在一定程度的基因交流。

2.2 遗传结构分析

基于贝叶斯算法的Structure软件对所有羌活和宽叶羌活的取样种群进行遗传聚类分析，由K的变化范围和K的似然概率变化曲线可知(图3，B、C)，所有个体的最佳分组为K=2，即将所有种群分为两个大组，如图3，A所示：羌活13个种群分为一个大组(绿色区域)，宽叶羌活10个种群分为另一个大组(红色区域)。聚类分析将羌活与宽叶羌活的自然种群分开，说明两个物种在DNA分子水平上出现了明显分化。然而，在两个大组之内一些种群(如种群YD、KZ、KO、C、G、H、HF和HH等)存在着基因型的混杂现象，说明两物种间存在一定程度的基因交流和遗传渐渗。

A. K=2时Structure分组图；B. K的变化范围图；C. K的似然概率变化图

分子方差分析(AMOVA)结果显示(表4)：两个羌活属物种种间变异占26.69%，种内群体间变异占15.60%，群体内变异占57.71%，表明羌活与宽叶羌活的遗传变异主要存在于种群内。在种内水平上，羌活群体间变异和群体内变异分别为18.02%和81.98%，宽叶羌活群体间变异和群体内变异分别为19.14%和80.86%。两个物种种间遗传分化系数(Fst)值为0.423，说明两物种间存在较高水平的分化。在种内水平上，羌活和宽叶羌活各自群体间内也存在着较高水平的遗传分化(羌活Fst=0.181，宽叶羌活Fst=0.191)。

表4 羌活与宽叶羌活的分子方差分析(AMOVA)

主坐标分析(Principal coordinates analysis，PCoA)的结果可以直观反映种群间的遗传相似性和遗传分化情况。本研究的主坐标分析结果显示(图4)，宽叶羌活10个种群亲缘关系较近，聚集在一个区域；羌活13个种群亲缘关系较近，聚集在另一个区域。羌活和宽叶羌活明显分为两个不同的遗传分组区域，显示两个物种间的遗传差异较大，分化程度高，单个物种在一个区域内的分布程度相对分散，说明群体间出现不同程度的分化，这种分化可能由群体内的遗传变异引起。

图4 羌活与宽叶羌活的主坐标(PCoA)分析Fig.4 Principal coordinates analysis of N. incisum and N. franchetii

3 讨 论

3.1 遗传多样性

Shannon多态性信息指数(I)可以作为衡量生物物种遗传多样性的一个指标，其值大小与等位基因数目有关。本研究中，羌活与宽叶羌活自然种群中检测到的I值分别为0.566和0.508，均大于0.5，因此认为两个物种自然群体具有较为丰富的遗传变异。比较其他遗传多样性参数发现，羌活的平均等位基因数(Na=2.603)高于宽叶羌活(Na=2.200)，但羌活种群间的杂合度变化范围较大，导致其观测杂合度的平均值(Ho=0.308)略低于宽叶羌活(Ho=0.320)。其中，观测杂合度(Ho)表示被检测位点上各群体中杂合子出现的频率，一般认为是度量群体遗传变异的一个最适参数，观测杂合度值越高，反映群体的遗传一致性就越低，其遗传多样性就越丰富[17]。此外，本研究检测到宽叶羌活群体近交系数(Fis)为负值，说明整体基因型表现为杂合子过剩，群体中存在一定程度的杂交和远交，而羌活群体近交系数(Fis)接近于零，也说明群体中存在一定的杂合子过剩情况。对于大多数野生植物来说，近交是造成群体杂合度下降的主要原因，这种现象很容易使物种丧失部分基因型，最终导致遗传多样性逐渐下降和衰退。据野外调查，目前野生羌活资源成片分布较少见，其零星残存野生分布区已上溯到海拔3 500 m甚至 4 000 m以上[18]，部分长期隔离的种群更倾向于近交从而导致杂合度下降，因此羌活各个种群杂合度差异较大。此外，本研究检测到羌活种群遗传多样性高于唐学芳等[19]对川产羌活遗传多样性的研究结果(I=0.2419,Na=1.4517)，可能与我们选取的羌活植物材料地理分布范围更大有关。与其他伞形科多年生草本植物相比[20-22]，本研究选取的两种羌活属植物具有较高的遗传多样性，可能与其较大的自然地理分布范围和种群长期的进化历史有关。

3.2 遗传结构和物种分化

遗传变异是生物多样性的核心，在生物多样性保护中具有重要意义[3]。分子方差分析结果显示，两个羌活属物种的种间变异较小(26.69%)，大部分变异存在于物种内(群体间15.60%，群体内57.71%)。根据基因组成的差异性，采用Structure聚类分析和主坐标(PCoA)分析，得到最佳分组结果为K=2，即将羌活和宽叶羌活的23个自然种群分为2个不同的遗传分组，分别对应于羌活和宽叶羌活2个物种，说明两物种间存在较高程度的遗传分化。采用2种不同的分析方法对群体遗传变异情况进行探究，虽然它们在结果表现形式上略有不同，但所揭示羌活与宽叶羌活的遗传分化较为一致，都表明两个物种间分化程度较高，并且遗传变异主要源自群体内。陈海铃等[23]使用这2种方法对濒危植物金茶花的遗传结构进行分析也得出类似结论，推测如果野生种群数量小且处于长期孤立状态，有可能导致同属近缘物种间高水平的遗传分化。

一般来说，影响群体遗传结构的主要因素有繁育系统和基因流模式等，自交类型植物群体间遗传分化较大，而异交类型植物群体间的分化一般较小[24]。据野生羌活人工引种栽培试验研究，发现羌活与宽叶羌活在海拔高度上存在部分生态位重叠，但宽叶羌活生态位更宽，更能够适应较低海拔的环境(2 500～4 000 m)，而羌活更能适应高海拔的环境(3 000～5 000 m)[25]。羌活与宽叶羌活采用异花授粉的方式进行繁殖，本研究检测到种间遗传分化系数(Fst)为0.423，说明地理隔离导致两个物种间基因交流程度低，种间分化较大。进一步比较分析发现，羌活与宽叶羌活各自群体间均具有较高水平的遗传分化，但羌活群体间的分化程度(Fst= 0.181)低于宽叶羌活(Fst= 0.191)，这可能与过度采挖导致羌活集中分布于高海拔地区有关。由于种群减少和栖息地片段化导致羌活群体间存在一定程度的近交，基因组成趋于一致，所以羌活群体间变异成分较少。Gitzcndanner和Soltis对比分析了片段化分布小种群和广布近缘物种的遗传变异情况，发现虽然小种群并不代表遗传多样性丧失，但对大多数物种来说，它的确会造成总的遗传变异降低[26]，这可能是羌活遗传分化程度低于宽叶羌活的原因。综上，在濒危物种保护时，应根据遗传学分析的结果，对羌活和宽叶羌活各自群体划分为不同的地理单元进行科学管理和保护。