柴桂口服液对LPS诱导的小鼠炎症的抑制作用

肖 琦，贾妮娜，谢小东，施 君，陈晓霞，于美玲，韦英益，胡庭俊

(广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005)

柴胡和桂枝相关方剂具有抗炎、抗氧化、增强免疫力和改善代谢等作用[1]，以柴胡桂枝干姜汤为母本延伸出的药剂在临床中可用于治疗胃肠型感冒、溃疡性结肠炎、慢性胆囊炎和病毒性肝炎等疾病[2]，具有很好的抗炎效果。

本试验采用的柴桂口服液经由《伤寒论》中柴胡桂枝干姜汤设计而来，通过小柴胡汤和桂枝汤加减而成[3]。本试验参照文献[4-5]小鼠体内炎症模型构建方法，以脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)为致炎剂，建立小鼠体内炎症模型，研究柴桂口服液对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和一氧化氮(nitric oxide,NO)表达和分泌水平的调节作用，以期在临床用药时为该方剂的使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 柴桂口服液(批号:20190901)，河南牧翔动物药业有限公司中试生产，规格：1.44 g/mL ；地塞米松注射液(批号:180602)，上海同仁药业股份有限公司上海兽药厂产品，规格5 mg/5 mL；脂多糖(批号：320v0320)，北京索莱宝科技有限公司产品；小鼠TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β试剂盒(批号分别为M191008-102a、M190919-004a、M191008-104a、M91008-001a)，欣博盛生物有限公司产品；一氧化氮(NO)、总蛋白(Total protein，TP)试剂盒(批号分别为20191007、20190930)，南京建成生物试剂有限公司产品；Cham QTM Universal SYBR Qpcr master Mix(批号20210124)、StarScript Ⅱ First strand cDNA synthesis Mix(批号9AHO1)；RNA isolater R401-01(批号2021.05.17)，南京诺唯赞生物科技有限公司产品；氯仿、无水乙醇等为分析纯。

1.1.2 实验动物 4周龄昆明种小鼠70只，SPF级，临床健康，体重18 g～22 g，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号SCXK(湘)2016-0002。动物购买后适应性饲养5 d。饲养环境：室温25℃±2℃，相对湿度40%～75%，室内无对流风。

1.1.3 主要仪器 TECAN多功能酶标定量仪(Infinite M200 PRO)，帝肯(上海)贸易有限公司产品；Servicebio高速组织匀浆仪(kz-Ⅱ)，武汉赛维尔生物科技有限公司产品；实时荧光定量PCR仪(Roche LightCycler®96，瑞士罗氏(Roche)公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药物剂量使用换算 据文献[6]，在传统中药方剂中，牛平均体重约300 kg，单味药用量约15 g/头～35 g/头，一般药物用药剂量在25 g/头，鸡体重约1.5 kg，用药剂量为牛剂量的1/40～1/20，即单味中药用量约为0.625 g/只～1.25 g/只，柴桂口服液组方按照牛剂量约为144 g，换算后成年鸡用量约为3.6 g～7.2 g。采用体表面积法换算小鼠用量，由于没有鸡准确的体表面积，且鸡与兔体重相近，均计为1.5 kg，即采用家兔作为鸡的换算方法：常见实验动物兔(鸡)标准体重为1.5 kg，按照文献[7]中常用实验动物及人的体表面积比例(剂量换算用)所提及1.5 kg家兔与20 g小鼠换算系数为0.040，即小鼠的用药量应低于7.2×0.040/0.020=14.4 g/kg，所以灌胃小鼠时用药剂量应在14.4 g/kg以内，故本试验给药剂量设计为2.5、5、10、15 g/kg。

1.2.2 动物分组与处理方法 动物分组方法参照文献[8]分组方法，将70只SPF级雌雄各半的昆明小鼠采用分层随机分组法分为7组，分别为空白对照组、LPS对照组、地塞米松组(5 mg/kg体重)、柴桂口服液Ⅰ～Ⅳ组(2.5、5、10、15 g/kg体重)。其中，地塞米松组灌胃纯化水(0.4 mL)，同时腹腔注射5 mg/kg体重(0.2 mL)地塞米松溶液；柴桂口服液Ⅰ～Ⅳ组分别按各组剂量灌胃柴桂口服液(0.4 mL)，腹腔注射生理盐水(0.2 mL)；空白对照组与LPS对照组灌胃纯化水(0.4 mL)，同时腹腔注射生理盐水(0.2 mL)；各组每日给药1次，连续5 d，于最后一次给药1 h后，除空白对照组腹腔注射生理盐水，其余各组参照文献[9]LPS小鼠体内炎症模型构建方法，腹腔注射10 mg/kg体重的LPS溶液建立小鼠体内炎症模型。LPS处理后6 h，CO2窒息处死小鼠并进行解剖，观察解剖后的脏器变化情况，采集脾脏，称重，放入灭菌的EP管中，置-80℃保存备用。

1.2.3 脾脏组织中炎症因子分泌水平的测定 LPS处理后6 h，处死小鼠并进行剖检，观察脏器变化情况，采集脾脏，称重，放入灭菌的EP管中，置-80℃保存备用。取1/2脾脏组织，按照质量体积比1∶9加入生理盐水，使用高速匀浆仪在60 Hz频率下，匀浆2 min，1 500 r/min离心10 min，取脾脏匀浆上清液，依据试剂盒说明书检测脾脏组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、NO和TP含量。

1.2.4 引物设计 根据GenBank中相关基因序列设计TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β等引物，引物由广西南宁市擎科生物技术有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.5 RT-qPCR检测脾脏组织中炎症因子表达量 取小鼠脾脏组织，按试剂盒说明书提取总RNA和反转录，反转录前检测RNA完整性；用实时定量PCR方法对目的基因和内参基因进行PCR扩增，反应条件如下：95℃预变性30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40个循环，检测各基因表达量。基因表达采用2-△△CT法计算基因的相对表达量。

2 结果

2.1 临床表现

除空白对照组外，其余各组在腹腔注射LPS溶液建模6 h后，各组小鼠出现扎堆、眼睛分泌物增多、精神沉郁等现象，造模期间无死亡。

2.2 柴桂口服液对小鼠脾脏中炎性因子含量的影响

在连续5 d灌胃不同剂量柴桂口服液后，对小鼠腹腔注射LPS建立体内炎症模型，LPS对照组脾脏匀浆中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β和NO含量显著高于空白对照组(P<0.05)；地塞米松组各炎性因子含量均显著低于LPS组(P<0.05)；柴桂口服液Ⅰ组脾脏匀浆液中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β含量与LPS组相比无显著差异(P>0.05)，NO含量显著低于LPS组(P<0.05)但与空白对照组无显著差异(P>0.05)，柴桂口服液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组脾脏匀浆液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量显著低于LPS对照组(P<0.05)，柴桂口服液Ⅲ、Ⅳ组脾脏匀浆液中IL-8含量显著低于LPS对照组(P<0.05)，柴桂口服液Ⅰ至Ⅳ组NO含量均显著低于LPS模型组(P<0.05)(表2)。

表2 柴桂口服液对小鼠脾脏中炎性因子分泌的影响

2.3 柴桂口服液对小鼠脾脏中炎性因子表达的影响

各组在腹腔注射LPS后，脾脏组织中TNF-α、IL-1β表达均显著高于空白对照组(P<0.05)；柴桂口服液Ⅰ、Ⅳ组与地塞米松组脾脏中TNF-α表达显著低于LPS对照组(P<0.05)；柴桂口服液各剂量组及地塞米松组的IL-6、IL-1β、IL-8表达显著低于LPS对照组(P<0.05)，其中，柴桂口服液Ⅰ、Ⅳ组IL-6的表达与地塞米松组无显著差异(P>0.05)，柴桂口服液Ⅰ组IL-1β表达与地塞米松组无显著差异(P>0.05)，柴桂口服液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组IL-1β的表达显著低于地塞米松组(P<0.05)(表3)。

表3 柴桂口服液对小鼠脾脏中炎性因子基因表达水平的影响

3 讨论

脂多糖是一种重要的炎症诱导因子，广泛用于体内外炎症模型的构建，在体内注射以后可导致血液和组织中炎性因子分泌水平上升，有良好的致炎效果，它可以通过激活TLR4/NF-κB信号通路，诱导单核巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的过量表达，介导免疫应激引起的炎症反应[10]。但在体内炎症模型中，根据不同的试验需求使用的剂量和作用时间不同[11]，本次试验选用10 mg/kg体重腹腔注射LPS溶液成功建立小鼠体内炎症模型，临床可见各LPS腹腔注射组小鼠出现扎堆，眼睛分泌物增多，LPS组脾脏匀浆液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和NO含量显著高于空白对照(P<0.05)，IL-1β、IL-6、TNF-α与IL-8的表达量显著高于空白对照组(P<0.05)，与文献[4-5]模型建立结果相似。

许多中药及其提取物可以调节机体炎症因子分泌，具有保护神经、抗病毒、抗炎等作用，如柴胡的主要活性成分柴胡皂苷具有较强抗炎活性，它能够抑制促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达从而增强抗炎性细胞因子转化生长因子-β1 的表达[12]，NF-κB信号通路是柴胡皂苷发挥抗炎作用主要抑制的抗炎信号通路[13]。许多研究表明含有柴胡、桂枝的组方具有抗炎等作用，与本次试验结果相似[14]。

本试验连续5 d灌胃小鼠2.5 g/kg～15 g/kg柴桂口服液后，用LPS建立炎症模型，并以地塞米松为阳性药物对照，随着药物剂量的增加，脾脏IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β含量呈下降趋势，且柴桂口服液Ⅰ组与Ⅳ组的IL-6 、IL-8、TNF-α、IL-1β水平皆有显著差异，呈现出一定的量效关系；脾脏NO水平呈下降趋势。与之相似，脾脏组织中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的表达量随着用药剂量的增大相比于LPS对照组呈现出下降趋势。

本研究证实10 mg/kg LPS可以作为一种小鼠体内炎症模型的建模剂量，并可以取得较好的建模效果；柴桂口服液在2.5 g/kg体重～15 g/kg体重剂量范围内，可以降低LPS诱导小鼠的体内炎症模型脾脏组织中炎症因子的基因表达及分泌，具有较好的抗炎作用，对机体有一定的保护作用，其抗炎机制的临床应用前景值得进一步研究开发。