大黄对小鼠水通道蛋白3、4及血管活性肠肽的影响

包佳鹭，赵 伟，路一璇，何 欣,3，刘海隆

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001； 2.涞水县农业农村局， 河北涞水 074119；3.河北省中兽药工程技术中心，河北清苑 071100；4.海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南海口 571100)

大黄(RheumpalmatumL.)是蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎，性寒,味苦，归大肠经，是我国传统四大中药之一，具有泻下攻积、清热解毒、活血化淤的功效[1]，常用于治疗大便秘结、牙龈肿痛、口舌生疮等各种常见病。大黄的主要作用部位在大肠，其重要活性成分结合蒽醌在大肠内细菌酶的作用下还原为游离蒽醌苷，刺激肠道导致腹泻[2]。现代药理学研究表明，大黄具有泻下、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎、利胆保肝、活血等多种作用[3]。大黄因其强大的泻下功能，不仅在便秘治疗上具有良好的疗效，同时也被广泛用于腹泻模型建立中。本试验通过检测血清及结肠组织中水通道蛋白3、水通道蛋白4和血管活性肠肽的表达情况，探究大黄致腹泻的主要机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与药物 昆明小鼠[SCXK(京)2016-0002]40只，雌雄各半，购于斯贝福 (北京) 生物技术有限公司；大黄，购自河北安国中药材市场。

1.1.2 试剂与仪器 AQP3抗体、AQP4抗体、VIP抗体、多聚体抗兔/小鼠IgG-HRP、DAB显色试剂盒，武汉博士德生物有限公司产品；AQP3、AQP4 ELISA试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司产品；Mark 酶标仪，Bio-Rad公司产品；KD-BM Ⅲ 组织包埋机，KEDEE公司产品；KD-2508切片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品；CK X41倒置生物显微镜，Olympus公司产品；SOP分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 大黄混悬液的制备 将大黄粉碎，过200目筛，临用前用60℃温水配制成所需浓度的混悬液。

1.2.2 给药方法 将小鼠随机分为4组，每组10只。空白对照组(A组)和大黄混悬液组(B、C、D组)，大黄组分别灌胃给予不同浓度的大黄混悬液(B组1 g/kg、C组2 g/kg、D组4 g/kg)，空白对照组给予等体积的生理盐水，连续灌胃5 d，给药前和给药后分别记录小鼠体重，每天记录采食量和腹泻情况。给药结束后眼眶静脉采血，脱颈椎处死小鼠，摘取结肠组织，一部分用40 mL/L多聚甲醛固定，一部分于-80℃保存备用。

1.2.3 结肠组织病理形态学观察 取部分固定结肠组织常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，常规HE染色，再经乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.4 ELISA检测AQP3、AQP4含量 小鼠眼眶静脉采血，分离血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中AQP3、AQP4含量。

1.2.5 免疫组化检测结肠中AQP3、AQP4、VIP表达量 取部分固定结肠组织常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，30 mL/L过氧化氢孵育，山羊血清封闭，滴加一抗，4℃过夜，次日滴加二抗，DAB显色后滴加终止液，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。用Image-Pro Plus软件对AQP3、AQP4、VIP的表达水平进行半定量分析。

1.2.6 荧光定量PCR检测结肠中AQP3、AQP4和VIP表达量 取-80℃保存的结肠组织匀浆，进行总RNA提取和反转录，荧光定量PCR采用两步法，扩增程序为：95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s，40个循环。熔解曲线程序为：95℃ 10 s,65℃ 60 s，以0.2℃/s的速度升温至97℃，最后37℃ 30 s冷却(表1)。

表1 荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 大黄给药前后小鼠体重变化

给药前各组小鼠体重无明显差异，给药后C组和D组小鼠体重显著低于A组 (P<0.05)。小鼠采食量随给药剂量的增加而不断减少。给药2.5 h后小鼠开始陆续出现腹泻症状，随给药剂量的增加，腹泻程度逐渐加剧，腹泻率增加。其中B组腹泻率为90%，C组和D组腹泻率均为100%(图1)。

2.2 ELISA检测大黄致泻小鼠血清中AQP3和AQP4变化

灌服不同剂量的大黄混悬液后，小鼠血清中AQP3和AQP4含量逐渐降低。C组和D组血清中AQP3和AQP4含量与A组相比显著降低(P<0.05)，B组与A组、C组和D组无显著差异(P>0.05)(表2)。

“*”代表与空白对照组差异显著(P<0.05) "*" Represents significant difference from the blank control group(P<0.05)

2.3 大黄致泻小鼠结肠组织病理形态学观察

各组结肠组织结构正常，黏膜完整，未见增生，萎缩，坏死等病理变化，杯状细胞，隐窝，腺体结构正常，排列整齐，均未见明显变化(图3)。

2.4 大黄腹泻模型小鼠结肠免疫组化结果

灌服不同剂量的大黄混悬液后，小鼠结肠中AQP3、AQP4和VIP的表达量均有所下降，且呈现剂量依赖趋势。C组和D组结肠中AQP3表达量显著低于A组，A、B组间无显著差异(P>0.05)。C组和D组结肠中AQP4表达量显著低于A组，且D组AQP4表达量与C组相比显著降低(P<0.05)，A、B组间无显著差异(P>0.05)。C、D组结肠中VIP表达量显著低于A、B组，A组和B组、C组和D组间差异不显著(P>0.05)。

2.5 大黄腹泻模型小鼠结肠AQP3、AQP4和VIP的RT-qPCR结果

小鼠灌服不同剂量的大黄混悬液后，AQP3、AQP4和VIP的mRNA表达量均有所减少。大黄组结肠AQP3 mRNA与空白对照组相比表达量下调，其中2 g/kg组、4 g/kg组AQP3 mRNA显著低于空白对照组(P<0.05)，且2个试验组之间无显著差异(P>0.05)，1 g/kg组与空白对照组无显著差异(P>0.05)。各大黄组结肠AQP4 mRNA与空白对照组相比均显著下调，且各组之间差异显著(P<0.05)。各大黄组结肠VIP mRNA与空白对照组相比均显著下调，其中2 g/kg组、4 g/kg组VIP mRNA显著低于1g/kg组(P<0.05)，4 g/kg组与2 g/kg组无显著差异(P>0.05)。

表2 大黄腹泻小鼠AQP3、AQP4变化结果

表3 大黄致泻小鼠结肠AQP3、AQP4和VIP表达量

A.空白对照组;B.1 g/kg组;C.2 g/kg组;D.4 g/kg组(HE×400)A.Blank control group;B.1 g/kg group;C.2 g/kg group;D.4 g/kg group(HE×400)

A.空白对照组;B.1 g/kg组;C.2 g/kg组;D.4 g/kg组,箭头为AQP3阳性表达A.Blank control group;B.1 g/kg group;C.2 g/kg group;D.4 g/kg group,arrow indicates AQP3 positive expression

3 讨论

大黄性味苦寒，归于大肠经，能够清热泻火，除烦止渴[4]，主要用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽[5]，大黄泻下的主要作用部位在结肠[6]。结肠在维持机体体液和电解质平衡中起着重要的作用，正常情况下结肠上皮每天吸收1.5 L～2 L水产生脱水粪便[7]，结肠上皮水运输是通过细胞旁路和跨细胞通路来完成的，跨细胞通路又包括自由扩散和协助扩散(即水通道扩散)两种方式[8]。

A.空白对照组;B.1 g/kg组;C.2 g/kg组;D.4 g/kg组,箭头为AQP4阳性表达A.Blank control group;B.1 g/kg group;C.2 g/kg group;D.4 g/kg group,arrow indicates AQP4 positive expression

A.空白对照组;B.1 g/kg组;C.2 g/kg组;D.4 g/kg组,箭头为VIP阳性表达A.Blank control group;B.1 g/kg group;C.2 g/kg group;D.4 g/kg group,arrow indicates VIP positive expression

“*”代表与空白对照组差异显著(P<0.05)

水通道蛋白(AQPs)是几乎所有物种(包括病毒)中存在的跨膜蛋白家族,可选择性地将水或其他小分子物质运输到生物膜上[9]。研究证实AQPs广泛分布于肠道中[10]，在肠道通透性和液体的分泌与吸收中发挥重要作用，在肠道水液代谢中有着重要意义[11]。AQP3 是结肠吸收水分的重要通道，有研究表明AQP3在结肠黏膜上皮细胞质膜上高度表达[12]，其表达量水平与结肠对水的吸收功能密切相关，AQP3可控制水从肠道向血液传送，以此来调节粪便的含水量[13]。AQP3的低表达会影响水分从肠腔到肠壁的转运，使结肠对水的重吸收障碍，因此导致腹泻[14]。除AQP3外，AQP4是在结肠黏膜表达较高的水通道蛋白，可促进结肠上皮细胞对水的重吸收[15]。研究显示，5-氟尿嘧啶诱导的腹泻小鼠结肠中AQP4的基因表达水平显着下降，从而导致小鼠体重减轻和腹泻[16]。研究表明，轮状病毒腹泻小鼠结肠AQP4表达量显著降低，证实AQP4在腹泻中起重要作用[17]。本试验研究显示,大黄会导致结肠中AQP3和AQP4表达量下调，从而使结肠对水的吸收减少，使粪便含水量增加，进而导致腹泻。

VIP是肠道肌间神经从中的抑制性神经元递质,主要集中在结肠壁的平滑肌层[18]，在肠道蠕动时参与下行性松弛，主要起调节肠道运动的作用。研究表明，VIP与受体结合后可活化蛋白激酶A，引起平滑肌超极化，使结肠运动减慢[19]。VIP表达量的降低可使肠道动力和分泌功能紊乱，导致机体产生腹泻。研究发现脾虚大鼠结肠VIP含量显著下降，与本试验研究结果一致[20]。本试验研究发现,大黄可降低结肠组织中 VIP 的含量，通过降低VIP的含量对结肠平滑肌的蠕动产生影响，增强肠蠕动力，促进肠道运动。

本试验结果表明,大黄可导致血清和结肠中AQP3和AQP4表达量下降，使肠道内水分增多，同时结肠中VIP表达量下降，肠蠕动加快，从而导致排便增加，引起腹泻 。