猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性双价纳米抗体原核表达及活性鉴定

王长江，曲光刚,*，武曰星，郭广君，韩 强，赵中伟，沈志强,*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原[1]，还可引起感染猪的免疫抑制和猪皮炎与肾病综合征(PNDS)、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤等疾病[2]。现阶段猪群感染PCV2后尚无特效治疗性药物，对PCV2相关疾病的防控主要集中在防止继发感染、提高机体抵抗力等方面。纳米抗体(nanobody，Nb)[3]具有稳定的分子结构以及良好的热稳定性，可溶性极高，不易聚集，能耐强酸、强碱等致变性条件，适于原核表达和各种真核表达系统[4]，并且已被证明具有高效的抗原结合活性。Nb许多方面均优于传统抗体，在治疗性抗体药物研发[5]、临床体外诊断[6]、肿瘤研究和免疫学研究等领域[7]均获得广泛应用。但其在临床应用过程中也存在半衰期短、有效性相对较低等不足。多价抗体是识别同种或不同表位的单价抗体的聚合物，比单价抗体具有更高的抗原亲和活力，并且能够显著延长在体内的半衰期[8]。自双特异性抗体药物Blinatumomab进入市场以来，人们对双价和双特异性抗体的研究兴趣日益增加[9]。双价双特异性抗体能够识别相同抗原或不同抗原上的多种抗原表位[10]，因此具有更广泛的功能和用途。Nb因其结构简单、易于进行基因操作和可用原核或真核细胞进行表达的优势使其容易被开发成双价或双特异性纳米抗体。研究表明，双价纳米抗体对流感病毒的抑制作用至少是相应单价纳米抗体的60倍[11]。

因此，构建PCV2双价纳米抗体作为Cap蛋白的颉颃物，相较于单价纳米抗体可以有效提高其活性。本研究将筛选到的Cap特异性纳米抗体基因序列作为基本单元，通过原核表达系统制备了双价单特异性纳米抗体，以期为PCV2的抗原抗体检测和PCV2相关疾病的防控提供新型候选抗体工具。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及载体E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株购自宝生物工程(大连)有限公司；pCold-SUMO载体和PCV2 Cap蛋白特异性VHH基因由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室提供，其中Cap蛋白特异性VHH基因为本课题组利用噬菌体展示技术从前期构建的纳米抗体文库中淘选获得。

1.1.2 主要试剂 PCV2 Cap蛋白来自山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室；rTaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 5 000为宝生物工程(大连)有限公司产品；SacⅠ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶、T4 DNA连接酶为NEB有限公司产品；琼脂糖为Biowest公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒为美国OMEGA公司产品；Ni2+-NTA亲和层析柱为常州天地人和生物科技有限公司产品；氨苄青霉素(Ampicillin)为SIGMA公司产品；Anti His-tag (HRP)鼠源单抗购自康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 DNA Engine Dyad PCR仪为美国Bio-Rad公司产品；NanoDrop 2 000，酶标仪(multiskan FC型)、冷冻高速离心机(legend micro 17R型)为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；小型常规低压电泳仪(AE-8135 mypower 300)为日本ATTO公司产品；恒温金属浴(CHB-100)为杭州博日科技有限公司产品；全自动凝胶成像系统(610型)为北京赛智创业科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及VHHs片段PCR扩增 根据筛选的PCV2 Cap特异性VHH测序序列，用分子生物学软件Primer Premier 5.0设计两对特异性引物分别用于扩增上游VHHup片段和下游VHHdown片段；VHHup和VHHdown片段除两端酶切位点和附加序列不同外，中间为使用同一VHH基因模板扩增出的相同序列。VHHup片段扩增引物VHHup-F和VHHup-R分别含有SacⅠ和BamH Ⅰ限制性内切酶酶切位点，其中linker基因作为引物的一部分包含在VHHup-R中；VHHdown片段扩增引物VHHdown-F和VHHdown-R分别含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶酶切位点。重组质粒鉴定引物为pCold系列载体上提供的通用测序引物，VHH片段扩增及重组载体鉴定所用引物见表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以筛选获得的PCV2 Cap特异性VHH基因序列为模板，分别用VHHup-F/VHHup-R和VHHdown-F/VHHdown-R引物进行PCR反应；VHHupPCR产物预期大小约500 bp，VHHdownPCR产物预期大小约400 bp。VHH基因PCR反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。PCR产物通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。

1.2.2 双价VHH重组表达载体构建及鉴定 VHHdown片段与pCold-SUMO载体分别用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶进行双酶切，酶切产物分别纯化回收后经T4 DNA连接酶连接，转化至DH5α感受态细胞。用PCR方法对重组质粒鉴定，并送上海生工生物工程有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为VHHdown-pCold-SUMO。

VHHup片段与VHHdown-pCold-SUMO重组质粒分别用SacⅠ和BamH Ⅰ限制性内切酶双酶切，经T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞。通过菌液PCR方法和双酶切鉴定重组质粒；对鉴定为阳性的重组质粒进行测序验证。测序正确的重组质粒命名为biVHHcap-pCold-SUMO。

表1 VHH片段扩增及重组载体鉴定引物

1.2.3 双价单特异性VHH原核表达与纯化 将重组质粒biVHHcap-pCold-SUMO转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落过夜培养，次日将过夜培养物接种至新鲜LB培养基中，待细菌达到对数生长期时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达5 h；同时将单价重组质粒VHHdown-pCold-SUMO转化BL21(DE3)感受态细胞，以相同条件进行诱导表达；以未诱导的biVHHcap-pCold-SUMO/BL21和VHHdown-pCold-SUMO/BL21在相同培养条件下的结果作为阴性对照。诱导表达后菌体细胞经超声波破碎，高速离心分离上清和沉淀，将双价和单价VHH表达产物分别进行SDS-PAGE分析。

使用Ni2+亲和层析柱对原核表达的双价及单价VHH重组蛋白进行纯化，纯化后的VHH重组蛋白溶液采用BCA蛋白法含量检测试剂盒测定浓度。将纯化后双价VHH和单价VHH蛋白溶液稀释至1 mg/mL，4℃保存备用。

1.2.4 ELISA效价分析 参照文献[12]方法并做适当修改，使用间接ELISA方法检测纯化后VHH 重组蛋白的效价水平。以PCV2 Cap蛋白作为抗原包被96孔酶标板，以梯度稀释(1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000和1∶100 000)的双价VHH作为一抗与包被抗原进行反应，将单价VHH重组蛋白进行同步操作；以pCold-SUMO/BL21超声上清100倍稀释液作为阴性对照，以3% MPBS作为空白对照；以Anti His-tag (HRP)鼠源单抗作为二抗与VHH重组蛋白进行反应，用TMB底物显色后在OD450nm波长处读取吸光度值。

2 结果

2.1 目的基因的PCR扩增

以同一株PCV2 Cap特异性VHH基因为模板，分别用VHHup和VHHdown引物进行PCR扩增，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳。结果VHHup和VHHdownPCR产物片段分别位于约500 bp和400 bp位置(图1)，与预期目的片段大小相符。

M.DNA标准DL 2 000；1.VHHup PCR产物；2.VHHdown PCR产物

2.2 重组表达载体构建与鉴定

通过两步双酶切-连接反应，分别将VHHdown和VHHup目的基因依次克隆至pCold-SUMO载体中，转化DH5α感受态细胞，通过菌液PCR对双价重组质粒进行鉴定，结果阳性重组质粒扩增出预期大小约900 bp的特异性条带(图2)，重组质粒VHHup-VHHdown-pCold-SUMO经SacⅠ和Hind Ⅲ双酶切后得到约5 000 bp和900 bp两条带(图3)，与预期片段大小相符,表明双价重组质粒构建正确。

2.3 双价单特异性VHH原核表达与纯化

使用E.coliBL21(DE3)分别对PCV2 Cap双价单特异性和单价VHH同时诱导表达，对诱导表达后的产物和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示，双价与单价VHH重组蛋白主要以可溶表达形式存在于细胞破碎上清中，biVHHcap-pCold-SUMO/BL21表达产物在约45 ku处出现特异性条带，VHHdown-pCold-SUMO/BL21表达产物在约30 ku处出现特异性条带，而对应的未诱导菌无此条带(图4)，双价与单价VHH重组蛋白条带位置与预期目的蛋白大小相符。用Ni2+亲和层析柱对biVHHcap表达产物进行纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示biVHHcap重组蛋白能够通过亲和层析柱进行富集纯化(图5)，灰度分析显示纯化后目的蛋白条带含量在80%以上。

M.DNA标准DL 2 000；ctrl.PCR 阴性对照；1～6.双价重组菌菌液PCR结果

M.DNA标准DL 5 000；M1.DNA标准DL 2 000；1～2.双价重组质粒双酶切鉴定结果

2.4 ELISA效价分析

Cap蛋白特异性双价VHH和单价VHH重组蛋白纯化后分别以1 mg/mL为起始浓度进行梯度稀释，在1∶100～1∶50 000稀释度范围内，双价VHH重组蛋白的ELISA反应吸光值均高于相同浓度的单价VHH重组蛋白，表明双价VHH重组蛋白与抗原的结合活性较单价VHH更强；以样本OD450/阴性OD450 ≥3作为阳性判定标准，Cap特异性单价VHH ELISA效价约为1∶500，而双价VHH ELISA效价为1∶10 000以上，双价VHH的ELISA效价比单价VHH增加了20倍。

M.蛋白分子质量标准；1.未诱导VHHdown-pCold-SUMO/BL21超声后上清；2.未诱导VHHdown-pCold-SUMO/BL21超声后沉淀；3.诱导VHHdown-pCold-SUMO/BL21超声后上清；4.诱导VHHdown-pCold-SUMO/BL21超声后沉淀；5.未诱导biVHHcap-pCold-SUMO/BL21超声后上清；6.未诱导biVHHcap-pCold-SUMO/BL21超声后沉淀；7.诱导biVHHcap-pCold-SUMO/BL21超声后上清；8.诱导biVHHcap-pCold-SUMO/BL21超声后沉淀

M.蛋白分子质量标准；1.biVHHcap-pCold-SUMO/BL21诱导表达超声上清；2.过柱流穿液；3～6.biVHHcap-pCold-SUMO重组蛋白纯化结果

3 讨论

PCV2 ORF2编码的Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白和抗原决定簇，因此常被作为PCV2检测和疫苗研究的靶蛋白。为了解决PCV2检测和防控中存在的难题，本研究用原核表达系统制备了抗PCV2 Cap蛋白的双价单特异性纳米抗体，并对其活性进行了分析。双价或双特异性抗体由于其相对亲和力高、能够识别不同抗原表位，羊驼来源的VHH具有相对分子质量小、免疫原性低、可溶性高、结构稳定等优势，是双价或双特异性纳米抗体构成单元的理想选择[10]。本研究在两个相同纳米抗体片段之间引入(G4S)3-linker序列，以柔性连接的方式将Cap单价纳米抗体串联成双价单特异性纳米抗体。用羊驼免疫球蛋白IgG2a上铰链作为连接两个纳米抗体单元的桥梁，免疫球蛋白铰链的天然柔韧性保证了双价纳米抗体结构中每个结构单元活动的独立性。本研究构建的Cap双价单特异性纳米抗体使用了15个氨基酸序列长度的GS-linker，能够保证双价VHH重组蛋白中每个组分具有相对独立的结构和功能。

制备多价纳米抗体另一种相对便捷的方法是将小分子多聚结构与纳米抗体单分子进行融合表达，然后使其自发聚合形成多价纳米抗体。这种方法中小分子多聚结构的选择是多价纳米抗体是否制备成功的关键因素。有研究用谷胱甘肽S转移酶(GSTs)和霍乱毒素B亚基(CTB)作为聚合载体分别制备抗赭曲霉毒素的纳米抗体[13]，发现GST-VHH主要以单体形式存在，CTB-VHH主要以五聚体形式存在。本研究通过基因工程方法直接构建了双价纳米抗体的串联序列，保证了目的纳米抗体原核表达产物全部为双价，表达水平与单价纳米抗体原核表达水平相当，且容易通过载体上的标签进行纯化，降低了双价抗体的制备难度和成本。

图6 双价单特异性VHH与单价VHH ELISA效价水平

本文将Cap蛋白VHH制备成双价后有效提高了其亲和活性，双价VHH重组蛋白比其单价重组蛋白的ELISA效价提高了20倍。双价抗体中两个组成单元之间的连接方式也会对双价抗体重组蛋白的活性产生影响，传统的C端-N端连接方式可能会抑制双价抗体的抗原结合活性[14]。本文构建的Cap蛋白双价单特异性VHH中两个组成单元之间以(C-N)方式进行串联，后续研究可以尝试以(C-C)连接方式制备Cap蛋白双价VHH，并对其ELISA效价水平进行验证，为PCV2高亲和力多价纳米抗体的研制、检测及疫病防控提供新型抗体工具。