猪瘟病毒和猪圆环病毒2型二重荧光LAMP检测方法的建立

谢志勤，张民秀，谢芝勋，范 晴，罗思思，谢丽基，黄娇玲，王 盛，曾婷婷，张艳芳，李 孟，李 丹，邓显文，刘加波

(广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种急性和高度接触传染性疾病，以稽留高热、皮下出血、脾梗死等为特征，病死率高。 我国对CSF采取了很多严格的防疫措施,有效地控制了猪瘟的广泛流行,但是该病在我国以及世界许多养猪国家依然存在[1]。猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起的猪一种传染病，以早期淋巴结肿大，食欲不振，呼吸困难，腹泻，早产及死胎等为特征，发病率和病死率较高[2-4]。

近年由CSFV和PCV2共同感染引发猪病的报道较多[5-7]。原因是PCV2感染率高，导致一些猪场出现CSF免疫失败，从而引发PCV2感染的同时感染CSFV，临床表现为体温升高、急性死亡、怀孕母猪流产或死胎等，根据临床症状很难做出判断，需要借助实验室手段进行确诊。常用的实验室方法很多[8-14]。本研究分别在CSFV和PCV2特异性引物上标记不同的荧光基团和淬灭基团，经LAMP反应后，标识在CSFV和PCV2序列上的不同荧光基团断裂而游离，在特定的荧光通道下，游离的不同荧光基团发出不同的颜色，根据不同颜色一次反应能同时鉴别CSFV和PCV2。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 LAMP试剂盒(批号8Y007)，荣研生物科技(中国)有限公司产品；Bst3.0 DNA/RNA聚合酶，NEB公司产品；RNA/DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品；全血RNA提取试剂盒(货号：51025)，百代生物公司产品；premixTaqPCR试剂盒、PMD-20T载体，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 Loopamp实时浊度仪，日本荣研公司产品；核酸测定仪，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；多色荧光成像分析系统，美国Bio-Rad公司产品。

1.1.3 试验用毒株 猪瘟病毒石门株(F114)购自中国兽医药品监察所，本实验室保存；猪瘟兔化弱毒株(C株)，广西丽原生物股份有限公司提供；猪瘟病毒地方分离株：N 株/1986、B 株/1987、L 株/1988、 GXH-2/2000，广西兽医研究所分离鉴定并保存；猪圆环病毒2型BH5株，广西壮族自治区兽医研究所保存；猪口蹄疫O型灭活疫苗毒株，购自中国农业科学院自兰州兽医研究所；牛病毒性腹泻病毒Orevgon C24V株(BVDV Orevgon C24V)，购自中国兽药监察所；猪呼吸与繁殖综合征病毒( CH-1R株，美洲型)，购自哈尔滨维科生物技术开发公司；猪细小病毒 (PPV)、日本脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪布鲁氏菌2号(BS2)、猪链球菌2型(SS2)，广西壮族自治区兽医研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针设计 根据GenBank中收录的猪瘟病毒毒株E2基因(登录号：MK124646.1)和猪圆环病毒2型ORF2基因(登录号：KY947578.1)序列保守区域，通过MEGA 5.0在线比对分析，然后用Primer premier 5.0和Primer explore V4软件分别设计了2套用于LAMP特异性扩增的引物及探针。特异性引物包括外引物F3和B3，内引物FIP(FIP=F1c+F2)和BIP(BIP=B1c+B2)，探针1条。设计的探针序列介于F1c和B1c之间，在探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。CSFV-Probe探针的5′端标记荧光基团FAM，3′端标记了淬灭基团BHQ1，该基团在520 nm波长下发绿色光。PCV-Probe 5′端标记荧光基团Cy5.5，3′端标记淬灭基团BHQ2，该基团在690 nm波长下发红色光。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成,HPLC级纯化(表1)，引物位置示意图见图1。

1.2.2 病原核酸提取 按照RNA/DNA提取试剂盒说明书要求步骤进行病原核酸的提取，首先吸取250 μL 病毒液或经处理的临床样品上清液放到1.5 mL离心管中，加入病毒裂解液200 μL混合，然后按步骤进行病原RNA/DNA提取，最后加TE洗脱缓冲液25 μL离心洗脱RNA/DNA，分装，置-80℃保存备用。

表1 二重LAMP的引物序列

1.2.3 标准模板的制备 将提取的CSFV C株RNA反转录成cDNA,用CSFV外引物(CSFV-B3，CSFV-F3)扩增反转录后的cDNA模板，扩增产物片断大小约为224 bp。同样，用PCV外引物(PCV-F3，PCV-B3)扩增PCV2 BH5的DNA模板，扩增产物片断大小约为324 bp。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳切胶回收，与PMD-20T载体连接转化感受态细胞DH5α，经PCR和双酶切鉴定重组菌，用质粒小量试剂盒提取培养的阳性重组菌中的质粒。用Nano drop 2000测定提取质粒的浓度。按公式计算换为拷贝数：拷贝数(copies/μL)=6.02×1023/660×3 000×10-9×质粒浓度(g/μL)。将等量的2种模板按不同浓度进行配比或按梯度进行稀释，制备标准模板保存于-70℃备用或直接应用。

1.2.4 二重荧光LAMP反应的建立 将制备的CSFV C株和PCV2 BH5标准质粒，按不同的浓度进行配比混合，然后加入二重荧光LAMP反应体系，并对反应体系中引物浓度、探针浓度及退火延伸温度范围进行优化，优化的引物浓度、探针浓度及温度范围如下：内引物5 pmoL/μL～60 pmoL/μL，外引物1 pmoL/μL～20 pmoL/μL，探针0.1 pmoL/μL～1 pmoL/μL，退火和延伸温度范围60℃～68℃。

1.2.5 LAMP结果判定 将反应产物取出，置多色荧光成像分析系统中，选择520 nm和690 nm荧光通道下显色，在520 nm荧光通道下含有阳性对照的CSFV样品呈绿色，PCV2样品和对照样品为无色，在690 nm荧光通道下含有阳性对照的PCV2样品呈红色，CSFV和对照样品为无色，在520 nm和690 nm共同荧光通道下，有CSFV无PCV的样品呈绿色，有PCV无CSFV的样品呈红色，同时含有CSFV和PCV的样品呈黄色，对照样品为无色。在标准阳性和阴性样品成立的情况下，根据颜色判断样品检测结果，结果直观准确，容易判断。

图1 CSFV和PCV2 引物设计位置示意图

1.2.6 二重荧光LAMP特异性测试 提取CSFV F114、CSFV C、CSFV N/1986、CSFV B/1987、CSFV L/1988、CSFV GXH-2/2000的RNA和PCV2 BH5 的DNA。同时提取对照毒株PRRSV CH-1R、FMDV O型、BVDV Orevgon C24V、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的核酸，并测定其浓度，用建立的方法对这些病原核酸进行二重荧光LAMP扩增检测，验证本方法的特异性。

1.2.7 二重荧光LAMP敏感性和干扰性测试 将制备的CSFV C毒株和PCV2 BH5毒株的质粒标准模板测定浓度，根据浓度换算为拷贝数，然后作10倍梯度稀释，稀释范围为1×107～1拷贝/μL，将各梯度相同拷贝浓度的CSFV和PCV核酸等体积混合，利用本试验建立的二重荧光LAMP方法对CSFV和PCV混合模板进行测试，检验本方法的最低检出的拷贝数。同样，将不同拷贝浓度的CSFV和PCV核酸交叉两两等体积混合，利用本试验建立的二重荧光LAMP方法对CSFV和PCV混合模板进行测试，检验不同的模板浓度对本方法的干扰性。

1.2.8 临床样品检测验证 采集广西不同地区不同猪场患病猪的样品112份，包括猪全血59份、肺组织21份和淋巴结32份。

1.2.8.1 提取肺组织及淋巴结组织中病毒核酸 取适量的肺组织、淋巴结分别进行研磨，按1∶5加入灭菌的磷酸盐缓冲溶液(PBS)继续研磨匀浆，吸取1.5 mL匀浆放入到2 mL EP管中，置-70℃反复冻融 3次，8 000 r/min离心5 min，吸取上清液250 μL按RNA/DNA提取试剂盒提取核酸。

1.2.8.2 提取猪全血中病毒的核酸 取猪全血100 μL，按全血RNA提取试剂盒说明书中步骤提取核酸。将提取的核酸反转录成cDNA，然后用本试验建立的二重荧光LAMP进行扩增检测，同时用已建立的CSFV和PCV荧光定量PCR方法作为对比检测,对扩增阳性的产物送生物公司进行测序，以验证本方法建立的二重荧光LAMP的准确性。

2 结果

2.1 二重LAMP方法的建立

将制备的CSFV C和PCV2 BH5标准质粒加入到二重荧光LAMP反应，反应体系为25 μL，经优化后的最佳反应试剂如下：2×LAMP buffer 12.5 μL，Bst3.0 DNA/RNA 聚合酶320 U，40 pmol/μL内引物CSFV-FIP、CSFV-BIP、PCV-FIP和PCV-BIP各1 μL(工作终浓度1.6 pmol)，5 pmol外引物CSFV-F3、CSFV-B3、PCV-B3和PCV-F3各1 μL(工作终浓度0.2 pmol)，0.5 pmoL探针CSFV-Probe和PCV-Probe各1 μL(工作终浓度0.02 pmol)，cDNA或DNA模板2 μL，用灭菌超纯水补足25 μL。将各试剂轻轻混合，置Loopamp实时浊度仪或恒温水浴锅。经优化后最佳的退火延伸温度为62℃ 90 min，85℃ 5 min结束反应，结果见图2。 图2中A中含有CSFV品的1、2、4管呈绿色，含PCV2、 对照水及PRRSV CH1R的3、5、6管无颜色。图2B中含有PCV2 BH5样品的3～4管呈红色，含CSFV、对照水及PRRSV的1、2、5、6管呈无颜色。图2C中含有CSFV样品的1～2管呈绿色，含有PCV2 BH5样品的3管呈红色，同时含有CSFV C和PCV2 BH5样品的4管呈黄色，含有对照水及PRRSV CH1R的5管和6管呈无颜色。

A.520 nm；B.690 nm；C.520 nm和690 nm；1.CSFV F114;2.CSFV C株;3.PCV2 BH5;4.CSFV C+PCV2 BH5;5.对照;6.PRRSV CH1R

2.2 特异性测试结果

用建立的方法对CSFV和PCV2及对照毒株进行扩增。本方法只能扩增CSFV F114、CSFV C、CSFV N/1986、CSFV B/1987、CSFV L/1988、CSFV GXH-2/2000和PCV2 BH5毒株并显色，对照毒株PRRSV CH-1R、FMDV O型、BVDV Orevgon C24V、PPV、JEV、PRV、B.sius没有呈现任何颜色，即对照毒株没有扩增，毒株间没有交叉颜色出现，特异性良好，结果见图3。图3A中含CSFV的2、4～8管呈绿色，含PCV2 BH5、水、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的1、3、9～16管呈无颜色。图3B中含PCV2 BH5样品的1、4～8管呈红色，含CSFV、水、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的2、3、9～16管呈无颜色。图3C中含PCV2 BH5样品的1呈红色，含CSFV样品的2管呈绿色，同时含有CSFV和PCV2 BH5样品的4～8管呈黄色，水、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的3、9～16管呈无颜色。

2.3 敏感性测试结果

用本方法对制备的标准模板浓度分别为1×107～100拷贝/L进行检测，结果本方法最低检出100拷贝/L的CSFV和PCV2混合模板，结果见图4。图4中1～8管分别为107～100拷贝/L的CSFV和PCV2混合模板标准品。图4A中1～6管呈绿色，7～8管呈无色。图4B中1～6管呈红色，7～8管呈无色。图4C中1～6管呈黄色，7～8管呈无色。

A.520 nm；B.690 nm；C.520 nm和690 nm；1.PCV2 BH5;2.CSFV石门株;3.对照;4.CSFV C+PCV2 BH5;5.CSFV N+PCV2 BH5;6.CSFV B+PCV2 BH5;7.CSFV L+PCV2 BH5;8.CSFV GXH-2+PCV2 BH5;9.FMDV O型;10.BVDV Orevgon C24V;11.PPV;12.JEV;13.PRRSV CH1R;14.PRV;15.BS2;16.SS2

2.4 干扰性测试结果

将CSFV C和PCV2 BH5标准模板按不同浓度进行组合，制备不同模板浓度的混合样品，用建立的方法进行检测，不同模板浓度的混合样品如下：样品1(107CSFV+100PCV)，样品2(106CSFV+101PCV)，样品3(105CSFV+103PCV)样品4(104CSFV+104PCV)，样品5(103CSFV+105PCV)，样品6(101CSFV+106PCV)，样品7(100CSFV+107PCV)。结果当两个模板浓度不同时，尤其是一个模板浓度高，另一个模板浓度低时，本方法仍然可鉴别检测到不同的两个模板，即不同的模板浓度对本方法干扰性小，结果见图5。图5A中1～5管呈绿色，6～7管无色。图5B中3～7管红色，1～2管无色。图5C中1～2管绿色，7～8管红色，3～5管黄色。

A.520 nm；B.690 nm；C.520 nm和690 nm；1～8.107～100拷贝/L CSFV和PCV混合模板标准品

A.520 nm；B.690 nm；C.520 nm、690 nm；1.107CSFV+100PCV；2.106CSFV+101PCV；3.105CSFV+103PCV；4.104CSFV+104PCV；5.103CSFV+105PCV；6.101CSFV+106PCV；7.100CSFV+107PCV

2.5 临床样品验证

用建立的二重荧光LAMP对临床样品112份进行检测，结果CSFV阳性的样品41份，检测阳性率36.6%，PCV2阳性样品8份，检测阳性率为7.14%。CSFV和PCV2同时为阳性的样品5份，混合感染率为4.46%，与荧光定量PCR方法检测结果一致。检测的所有阳性样品产物送生物公司测序，测序结果经序列比对分析均为对应病毒。

3 讨论

LAMP核酸扩增方法是在恒温下进行扩增，操作比较简便，成本低廉，被广泛应用于各种疾病的诊断[15-16]。在LAMP的基础上已成功开发出多种颜色的多重LAMP方法，能有效鉴别多种病原体[17]。本研究是在FIP与BIP引物之间设计了一条Taqman 探针，在探针的5′端标记不同的荧光基团，在3′标记有淬灭基因。探针本身并不会发光，当加入LAMP反应中，探针序列结合到模板序列上，随着内外引物特异性结合延伸，迫使与模板结合的探针断裂，荧光基团与淬灭基团断开，荧光基团成为游离基团，这样游离的荧光基团在没有淬灭基团淬灭的情况下发出荧光。本研究采用的FAM荧光基团，在波长520 nm荧光通道下，游离的FAM荧光基团激发绿色，在波长690 nm荧光通道下，游离的CY5.5荧光基团激发红色。本研究通过反应后颜色的不同来区分不同的病毒，并获得成功。

为了获得稳定的最佳的扩增效果，本研究对反应中的引物浓度、探针浓度及反应试剂程序进行了优化。在引物浓度和探针浓度的优化中，发现内引物浓度用量最高，其次为外引物浓度，探针浓度用量最低，它们之间的浓度应用比约为80∶10∶1。在反应程序的优化中，发现最佳反应程序为：退火延伸温度62℃ 90 min，85℃ 5 min结束反应。应用优化后的引物浓度、探针浓度及反应试剂程序，获得了最佳的LAMP扩增效率。

本研究采用Bst3.0 DNA/RNA聚合酶进行二重荧光LAMP扩增，与采用Bst2.0 DNA聚合酶和BstDNA聚合酶大片段的二重荧光LAMP相比，具有更佳的的延伸能力活性、更强的逆转录活性以及强烈的链置换活性。以研究的引物组、Bst3.0 DNA/RNA聚合酶及试剂进行扩增，一次加模板就能完成LAMP扩增，不需要预先对RNA模板单独进行逆转为cDNA，尤其是对DNA和RNA混合模板，特别是含有二级复杂结构的RNA模板检测特别方便，而采用Bst2.0 DNA聚合酶或BstDNA聚合酶大片段进行二重荧光LAMP时则无法对有二级复杂结构的RNA模板进行扩增。

本研究建立的荧光方法，反应结束后直接通过仪器读取或凭肉眼判定反应结果，不需要通过电泳或打开反应盖添加染料，这样极大地降低了LAMP的污染。有条件的实验室，建议在超净工作台中配制试剂，减少空气中的气溶胶对的污染，确保样品检测的准确性。

为了进一步验证建立方法的实用性，用优化后建立的方法对保存的临床样品的进行检测，同时采用比较成熟敏感的荧光定量PCR方法进行对比，结果发现，本研究获得的结果与荧光定量PCR方法获得的结果一致。为了防止假阳性的出现，阳性样品产物经序列测定，分析比对结果全为对应病毒，说明本研究建立的方法准确，适合于临床样品的检测。本研究建立的二重LAMP检测方法，一次反应能同时鉴别CSFV和PCV2，为区分CSFV或PCV2提供了技术支撑。