辣木籽多糖的研究进展

董成国，罗成飞

(哈尔滨工业大学化工与化学学院)

0 前言

多糖，又称多聚糖，是一种高分子的聚合物，在自然界分布极广，在植物、动物和微生物体内均有存在。目前已报道的天然多糖化合物约有 300 多种，至少有 100 个以上的多糖正在进行临床试验，分别用于抗肿瘤、抗糖尿病、降血脂等疾病的治疗药物或作为抗炎、抗病毒的药物[1]，现已有多种多糖药物成功应用于临床，如香菇多糖、人参多糖及猪苓多糖[2]。多糖广泛存在于生物体内，是除蛋白质和核酸之外的一类重要的生物大分子，对维持生命机体正常运行具有重要作用。现代药理学研究表明多糖有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂和免疫调节等许多生理活性，且无毒副作用，成为食品科学、天然药物、生物化学与生命科学研究的热点。近年来，辣木多糖的研究也逐年多了起来。人们在辣木多糖含量、多糖种类、结构、活性等方面的研究取得了较好的进展。

1 有关辣木的研究

1.1 辣木及资源与分布

辣木(Moringa oleifera)别名洋椿树、鼓槌树。属于辣木科(Moringaceae)，辣木属(Moringa Adans.)，多年生植物[3]，由于其叶、籽、根和花均能食用，且具有增进营养和食疗保健功能，故被称之为“神奇之树”。国家卫生部于 2012 年批准辣木为新资源食品[4]。辣木主根粗壮，树根膨大；树冠伞形，主干直立，较脆；辣木叶为卵型、椭圆形或宽椭圆形，无毛；花为两性花，圆锥形花序，左右对称腋生，具有独特芳香气味，开花时向下向外弯曲，花瓣呈白色或奶黄色；果实为三棱状，成熟后呈褐色，种子为深褐色。

辣木科只有 1 个辣木属，目前全球已发现 14 个种，有 4 个种被成功驯化栽培。辣木主要分布在印度、中国、日本、埃及、埃塞俄比亚、肯尼亚、安哥拉、纳米比亚、苏丹，美国、墨西哥等 30 多个热带、亚热带国家和地区[5]。我国于 20 世纪 60 年引种，并在台湾、广东、海南、云南南部地区种植[5]。

1.2 辣木有效成分研究进展

辣木油是从辣木种子里提取出的含有大量单不饱和脂肪酸的植物油脂[6]，具有氧化稳定性高，氧化诱导期长等优点[7]。段琼芬等[8]采用超临界二氧化碳萃取技术提取辣木籽油，结果表明辣木籽油主要由脂肪酸组成，其中油酸含量占 65.63%，并含有 1%～3%的饱和烃、醛和醚、酯，1.95%的菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和岩藻甾醇。刘红等[9]采用无水乙醇和乙酸乙酯萃取辣木籽油并通过色谱-质谱连用技术分析其化学成分，得出 2 种方法萃取的主要化学成分是油酸、异油酸、反油酸、甘油单油酸酯和棕榈酸。

辣木蛋白是一种极具开发价值的功能性成分。研究表明，辣木含有大量的蛋白质，可作为优质蛋白质资源加以开发利用。辣木叶粉中蛋白质可与大豆相媲美。樊建麟等[10]研究表明，辣木籽中含有 17 种氨基酸，其中必需氨基酸占总氨基酸含量的 35.20%。

辣木黄酮是辣木中主要功能性成分之一[11-13]。Vongsak 等[14]应用传统的提取技术提取辣木中的黄酮类物质，发现 70 %的乙醇溶液浸泡提取可获得最大的提取率，同时提取液的抗氧化性也最高。王苗苗等[15]采用超声波辅助提取辣木叶总黄酮，并利用响应面法对提取工艺参数进行优化，在最佳工艺条件下总黄酮提取率为 5.17 %。梁鹏等[16]以辣木茎叶干粉为原料，采用水为提取剂，辣木粗多糖的提取率为 5.66 %。Asghari 等[17]对辣木干叶和种子的有效成分的研究显示，辣木富含维生素 C 和维生素 A。其中维生素 C 含量在干叶及种子中的含量分别为 83±0.5，14±0.6 mg/100 g；维生素 A 的含量分别为 6.8±0.7，24.8±0.7 mg/100 g。

2 辣木多糖的研究现状

2.1 多糖的提取

目前植物多糖的提取方法包括传统的热水浸提法、酸提取法、碱提取法和酶提取法，现代新兴技术包括超声提取法[18,19]、微波提取法[20]、超高压法[21]、脉冲电场[22]及传统与现代相结合的多技术联合使用方法[23-25]。以下简述几种最常采用的提取方法的原理和各自的优缺点。

2.1.1 热水浸提法

水是强极性溶剂，对植物组织的渗透力强，可利用多糖溶于水而不溶于高浓度醇溶液的性质将多糖提取出来。影响多糖提取率的因素较多，大多数研究采用正交设计和响应面分析法对不同多糖的热水浸提工艺条件进行优化[26]。热水浸提法成本低，安全，在分离提取中应用最为广泛[27]，但提取率不高。

2.1.2 酸、碱提取法

酸、碱提取法利用植物的细胞、细胞壁在酸性和碱性的溶液中溶胀、破裂而使多糖溶出，提高多糖的提取率，但酸碱提取法有其特殊性，因多糖的不同而异。在提取过程中应严格控制酸碱度，避免多糖的糖苷键发生断裂，提取后提取液应迅速中和或者进行透析。

2.1.3 生物酶提取法

生物酶提取法是在提取过程中加入相应的酶来分解细胞壁，从而加速多糖的释放，提高多糖提取率。酶法提取条件温和，耗时短，去杂质容易，对多糖的结构破坏性较小等优点，但缺陷在于成本高，对设备要求高，不适合大规模工业化生产。

2.1.4 超声辅助提取法

超声辅助提取法是利用超声波产生强烈的机械效应、热学效应以及空化作用，导致细胞壁破碎，增加提取液的穿透力，加速胞内有效物质的释放、扩散和溶出。超声提取法具有提取效率高的优点，但超声可能会导致多糖分子结构的改变。

2.1.5 微波辅助提取法

微波提取法是通过微波作用使细胞内的极性分子迅速吸收能量，产生大量的热量，导致细胞内温度升高，压力增大，使细胞壁破裂，加速细胞内部的有效成分释放，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。此法提取时间短，提取率高。

2.2 多糖的纯化

多糖提取物中含有许多杂质需要除去。一般首先利用多糖难溶于有机溶剂的特点，用丙酮或乙醇等有机溶剂进行反复洗涤沉淀，除去一些醇溶性物质。此外，多糖提取物中常含有蛋白质、色素等非多糖组分。

2.2.1 脱蛋白

粗多糖中常含有大分子蛋白质，蛋白质与多糖结合，形成糖蛋白。脱除粗多糖中的蛋白，是多糖分离纯化中一大难题，但非常重要。目前，脱除蛋白的主要方法有化学法、物理法和生物法。化学法包括 Sevage法、三氯乙酸法[28]等。Sevage 法是利用蛋白质在氯仿等有机溶剂中变形的特点，使蛋白质发生变性沉淀，通过离心得方法将粗多糖中的蛋白质除去。该法条件温和，可避免多糖的降解。但该法需要反复处理多次，才能达到实验目的。多糖常因多次处理而损失。近年来，有不少研究结果表明，利用生物酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链蛋白酶等)将样品中蛋白质部分降解后，再利用 Sevage 法脱蛋白效果更好。三氟三氯乙烷法脱蛋白效率较高，但具有易挥发，不易出尽的缺点。物理法包括大孔吸附树脂法、等电点沉淀法等。生物法主要是利用生物酶对蛋白质进行酶解，从而达到脱除蛋白质的目的[29]。

2.2.2 脱色

植物多糖中含有的色素，其中包括游离色素和结合色素。根据不同色素类型采用不同的除色素方法。常见的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法[30]。过氧化氢是一种氧化脱色剂，该法容易引起多糖的降解，所以需要在低温下操作，且过氧化氢浓度不宜过高。吸附法是利用活性炭、硅藻土等的物理吸附作用达到脱色的目的。对于同时含有游离蛋白和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法，加入菲林试剂生成不溶性络合物，经分离后用阴离子交换树脂分解络合物[1]。

2.2.3 脱小分子物质

对于一些小分子物质，如无机盐、脱蛋白残留溶剂、低聚糖等可通过透析法除去。此法操作简单，但耗时长，处理量少。在后续的离子交换树脂柱层析和凝胶过滤柱层析中也可以将小分子物质除去。

2.3 多糖的分离

2.3.1 分级沉淀法

根据多糖在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同进行分离，常用的沉淀剂包括甲醇、丙酮、乙醇和异丙醇等。此法分离出的多糖多为多糖混合物。

2.3.2 膜分离法

膜分离主要包括超滤、微滤和纳滤，通过在膜两侧施加推动力，使处理液中的组分选择性的透过膜，从而实现物质的分离[31]。该法不涉及相变，无二次污染，且操作方便、是现代分离技术中效率较高的分离手段。

2.3.3 色谱分离法

色谱分离是根据多糖中各组分在固定相和流动相之间的分布和流动速度不同来进行分离的一种方法[32]。主要包括离子交换色谱法和凝胶色谱法。离子交换是一个离子的吸附和解吸的过程，常用的阴离子交换剂有 DEAE-纤维素，DEAE-琼脂糖和 DEAE-葡萄糖，流动相可用水和不同浓度的缓冲盐溶液。阴离子交换色谱法适用于各种酸性、中性多糖和粘多糖的分离纯化。凝胶色谱是根据多糖的分子量大小不同而分离的方法，常用的凝胶有琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶等，流动相为不同浓度的盐溶液和缓冲液[33,34]。

2.3.4 多糖的纯度及分子量测定

目前，多糖纯度鉴定的方法有 HPLC 法、毛细管电泳法、凝胶柱层析法、薄层层析法等。纯度鉴定需要用两种以上的方法才能证明多糖样品的均一性。其中 HPLC 法和凝胶柱层析法是常用的方法。应用 HPLC 法时，需要多糖样品的 HPLC 谱图为单一对称峰，凝胶柱层析法需要多糖洗脱曲线呈现单一对称峰。

多糖的分子量测定是多糖研究中重要的一项工作，多糖的性质往往与它的分子量有关。目前，多糖分子量的测定方法有：凝胶过滤发、质谱法、粘度法、散射法、渗透压法、蒸汽压法等。凝胶过滤法是较为常用的方法。通过测定多糖样品的保留时间 tR，根据分子量已知的标准品的 tR，计算出样品的分子量。

2.3.5 多糖的结构解析

多糖作为天然的生物大分子，其结构和化学组成是影响其生物活性和理化性质的关键因素。目前对多糖的一级结构的分析方法有化学方法、仪器检测法、生物法。多糖一级结构的分析中大多采用化学法和仪器检测法相结合，可基本阐明某一多糖的一级结构的大致特征。而多糖高级结构的分析方法主要是物理方法，如 X 射线纤维衍射、核磁共振、电子衍射等。以下简述多糖一级结构的分析方法及其原理。

3 辣木多糖的生物活性研究进展

植物多糖具有广泛的生物活性，并能通过免疫调节作用发挥多种生理活性，近 20 年来，已经有大量研究对多糖的生物活性进行报道。如香菇多糖的免疫调节功能，它可作为 T 细胞定位的佐剂和辅 T细胞刺激参与机体免疫反应。一方面他能激活腹腔巨噬细胞的杀伤抗原能力，另一方面能恢复免疫功能，特别是能恢复 T 协助细胞的活性，同时提高抗胸腺依赖性抗原的体液性抗体水平。在抗氧化活性方面，现有的研究表明，许多植物多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化等活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用。在抗肿瘤活性方面，植物多糖的抗肿瘤活性是通过提高机体免疫力或抑制肿瘤 DNA、RNA 的合成来实现，因此，植物多糖具有不损伤正常细胞，而且无毒的优点。在降血糖活性方面，植物多糖的降血糖活性的机理可概括为：促进机体内部的葡萄糖转运，刺激机体外周围组织和加强靶器官对糖的利用，降低血浆中甘油三酯和胆固醇，保护胰岛 β 细胞。通过影响糖代谢酶的活性，从而促进汤圆合成或抑制肝糖异生等。除了以上所述活性外，植物多糖还具有很多其他的生物学功能。如降血脂活性、抗疲劳活性、抗病毒、抗炎活性等。

3.1 抗氧化性

辣木的各部位多糖提取物均具有体外抗氧化活性，已有研究表明多糖具有清除活性氧(ROS)自由基的能力。梁鹏[35]等人研究了辣木茎叶中水溶性多糖的抗氧化活性，试验得出多糖提取物对羟基自由基(OH-·)和超氧阴离子(O2-·)都有清除作用，且存在着剂量-效应关系。岳秀洁[36]对辣木叶多糖进行抗氧化性试验，得出多糖对氧自由基有吸收能力，对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、OH-·、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基(ABTS+·)均有较好清除效果，且存在明显的量效关系；董成国[37]试验证明辣木籽水溶性多糖对ABTS+·、OH-·有较好的清除能力，且粗多糖的抗氧化能力要高于精多糖。马波[38]对辣木多糖进行乙酰化修饰，改性后清除O2-·和OH-·能力显著增强。王瑞琴等[39]体外抗氧化活性结果表明辣木叶多糖具有良好抗氧化活性。胡玲华[40]体外抗氧化性活性研究结果表明：5.0 mg/mL的辣木籽多糖对羟自由基的清除率为91.1%；质量浓度为1.0 mg/mL的辣木籽多糖，对1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)的清除率可以达到38%；质量浓度为5.0 mg/mL的辣木籽多糖对超氧化阴离子的清除率可以达到59%。

3.2 降血糖

辣木多糖有降血糖的功效。汪芳[41]采用HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型,以细胞葡萄糖消耗量为指标,考察辣木叶多糖的降糖作用。结果表明,辣木叶多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖及半乳糖组成。与模型组相比,辣木叶多糖组分MOs-2-a、MOs-2-b均能显著增加胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)。认为辣木叶多糖MOs-2-a、MOs-2-b具有良好的降糖效果。岳秀洁[36]试验证明印度传统辣木叶多糖对猪胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，且存在剂量-效应关系。汪芳[41]实验结果证明辣木叶多糖具有良好的降糖效果，他应用HepG2细胞建立出胰岛素抵抗模型，以细胞葡萄糖消耗量为指标得出此结论。

3.3 抗病毒

辣木多糖具有较好的抗病毒活性。杜洋[42]采用体外细胞培养法对辣木多糖抗丙型肝炎病毒(HCV)的活性进行研究，结果表明，试验中得出浓度在安全浓度范围内，辣木多糖对人肝癌细胞(Huh7.5.1)细胞无毒性作用，运用荧光PCR法测定得到辣木多糖对HCV有一定的抗病毒活性，同时采用先加多糖后加病毒的作用方式优于其他两种方式，并且多糖的最适浓度为62.5 μg/mL，存在一定的浓度依赖性。