分蘖洋葱化学成分及其抑菌活性

顾承真李 婷曾碧雪李文娟吴凤芝曾任森

（1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州350002； 2.福建农林大学农学院，福建 福州350002；3.东北农业大学园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨150030）

分蘖洋葱Allium cepaL.var.agrogatumDon.属于百合科葱属一年生草本植物，是洋葱的变种之一。在我国黑龙江、吉林等地广泛种植，资源丰富。分蘖洋葱是一种独具特色的药食同源的保健品，营养丰富，药用价值也较高。分蘖洋葱鳞茎中含有大蒜素等多种植物杀菌素，具有很强的杀菌能力［1⁃2］。近年来学者对其化学成分进行了研究，发现分蘖洋葱主要成分包括分蘖葱头苷、黄酮类化合物［3⁃4］、含硫化合物、前列腺素A1［5］、甾体皂苷［6］、微量元素和氨基酸等［7］。研究表明黄酮类化合物对自然界中许多病原微生物具有抑制和杀灭作用［8］。目前，天然产物的抑菌作用受到了广泛关注，尤其是黄酮类化合物。黄瓜根分泌物中含有的7，8⁃苯并黄酮能够显著抑制黄瓜枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发［9］。但分蘖洋葱中含有的黄酮类成分对农作物病原菌的抑制作用有待于研究。

番茄枯萎病是由半知菌亚门镰刀菌属尖孢镰刀菌Fusarium.oxysporiumSchl.引起的一种土传性、系统性病害［10⁃11］。前期研究发现分蘖洋葱乙醇提取物对番茄枯萎病病原菌的生长具有抑制作用，但具有抑制番茄枯萎病病原菌生长的物质基础尚不明确。因此，本研究从分蘖洋葱中分离得到2 个黄酮、1 个木脂素类化合物和1 个氨基酸，并用微量稀释法测定了这些化合物对番茄枯萎病病原菌生长的影响。

1 材料

斜式N⁃1100S⁃W 旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；KQ3200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；VS⁃840 K⁃U 超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；BS⁃100A自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；1000Y 多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；HVE⁃SO 型高压灭菌锅（华粤企业集团有限公司）；SHB⁃ⅢA 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；ZF⁃20D 型暗箱三用紫外分析仪（骥辉分析仪器有限公司）；FPQ⁃300CY⁃30D 型人工气候箱（宁波莱福科技有限公司）。GF254薄层硅胶（200 mm×200 mm，青岛海浪硅胶干燥剂厂）；Bruker 600 MHz 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1290⁃6545 飞行时间质谱仪测定（美国Agilent 公司）；半制备液相色谱（江苏汉邦科技有限公司）；Ultimate XB⁃C18半制备色谱柱（21.2 mm×250 mm，5 μm，月旭科技股份有限公司）。

分蘖洋葱由东北农林大学吴凤芝教授提供并鉴定为正品，番茄枯萎病病原菌Fusarium oxysporumf.sp.LycopersiciSnyder et Hansen 菌株由福建农林大学作物科学学院作物抗性与化学生态学研究所提供。

2 提取与分离

15 kg 分蘖洋葱剥去鳞茎外皮，粉碎机粉碎成泥，在室温下用95%乙醇浸提3 次，每次24 h，合并3 次提取液、减压浓缩得到浸膏（1.6 kg）。适量蒸馏水稀释，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取部分（50 g）、乙酸乙酯萃取部分（210 g）、水部分（1.3 kg）。取分蘖洋葱乙醇提取物的乙酸乙酯部分，加少量甲醇溶解、过滤，上凝胶Sephadex LH⁃20 柱，用甲醇⁃水（10 ∶90～100 ∶0）梯度洗脱，得到4 个部分Fr.A～D。Fr.A 上C18柱，用甲醇⁃水（10 ∶90～100 ∶0）洗脱，得到Fr.A1～A5，Fr.A2 经MCI 柱纯化，甲醇⁃水（20 ∶80）洗脱，得化合物2（53 mg）；Fr.A4 上MCI 柱纯化，用甲醇⁃水甲醇⁃水（35 ∶65）洗脱，得化合物1（141 mg）；Fr.A5 上MCI 柱纯化，再用半制备液相甲醇⁃水（25 ∶ 75）纯化，得化合物3（15 mg）。Fr.B 用C18柱分段甲醇⁃水（10 ∶90～100 ∶0），得到6 个部分Fr.B1～B6。Fr.B2 上MCI柱纯化，用甲醇⁃水（40 ∶60）洗脱，得化合物4（23 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：黄色粉末，分子式C15H10O7。ESI⁃MSm／z：303.0 ［M ＋H］＋。1H⁃NMR（DMSO⁃d6，600 MHz）δ：12.46（1H，s，OH⁃5），10.80（1H，s，OH⁃7），9.63（1H，s，OH⁃4′），9.35（1H，s，OH⁃3），9.34（1H，s，OH⁃3′），7.70（1H，s，H⁃2′），7.57（1H，d，J＝8.5 Hz，H⁃6′），6.91（1H，d，J＝8.5 Hz，H⁃5′），6.51（1H，s，H⁃8），6.22（1H，s，H⁃6）；13C⁃NMR（DMSO⁃d6，150 MHz）δ：156.6（C⁃2），136.7（C⁃3），176.5（C⁃4），162.4（C⁃5），98.6（C⁃6），164.6（C⁃7），94.1（C⁃8），156.8（C⁃9），104.3（C⁃10），122.6（C⁃1′），115.6（C⁃2′），145.7（C⁃3′），147.3（C⁃4′），116.1（C⁃5′），120.8（C⁃6′）。以上数据与文献［12］ 报道一致，故鉴定为槲皮素。

化合物2：黄色粉末，分子式C21H20O12。ESI⁃MSm／z：465.1 ［M ＋H］＋。1H⁃NMR（CD3OD，600 MHz）δ：6.36（1H，s，H⁃2′），7.55（1H，dd，J＝10.5，1.98 Hz，H⁃6′），7.28（1H，d，J＝10.44 Hz，H⁃5′），7.73（1H，s，H⁃8），6.16（1H，s，H⁃6），4.90（1H，d，J＝8.76 Hz，H⁃1″），3.52（1H，m，H⁃2″），3.56（1H，m，H⁃3″），3.48（1H，m，H⁃4″），3.44（1H，m，H⁃5″），3.93（1H，dd，J＝2.5，15.4 Hz，H⁃6a″），3.73（1H，dd，J＝6.54，15.4 Hz，H⁃6b″）；13C⁃NMR（CD3OD，150 MHz）δ：148.4（C⁃2），138.1（C⁃3），177.6（C⁃4），162.8（C⁃5），99.5（C⁃6），165.8（C⁃7），94.6（C⁃8），158.4（C⁃9），104.7（C⁃10），127.8（C⁃1′），117.7（C⁃2′），146.9（C⁃3′），148.2（C⁃4′），116.6（C⁃5′），121.4（C⁃6′），103.8（C⁃1″），74.9（C⁃2″），78.5（C⁃3″），71.5（C⁃4″），77.7（C⁃5″），62.6（C⁃6″）。以上数据与文献［13］ 报道一致，故鉴定为槲皮素⁃4′⁃O⁃β⁃D⁃葡萄吡喃糖苷。

化合物3：无色粉末，分子式C22H26O8。ESI⁃MSm／z：419.1 ［M ＋H］＋。1H⁃NMR（DMSO⁃d6，600 MHz）δ：3.09（2H，m，H⁃1／5），3.45（2H，m，H⁃4b／8b），3.73（2H，m，H⁃4a／8a），4.86（2H，d，J＝4.8 Hz，H⁃2／6），3.82（12 H，s，4⁃OCH3），5.43（2H，s，OH），6.61（4H，s，H⁃2′／6′／2″ ／6″）；13C⁃NMR（DMSO⁃d6，150 MHz）δ：53.7（C⁃1／5），56.1（4⁃OCH3），71.1（C⁃4／8），85.5（C⁃2／6），103.7（C⁃2′／6′／2″／6″），131.1（C⁃1′／1″），134.9（C⁃4′／4″），148.0（C⁃3′／5′／3″／5″）。以上数据与文献［14］ 报道一致，故鉴定为diasy⁃ringaresinol。

化合物4：白色粉末，分子式C11H12N2O7。ESI⁃MSm／z：205.1 ［M＋H］＋。1H⁃NMR（D2O，500 MHz）δ：7.62（1H，d，J＝9.5 Hz，H⁃4），7.42（1H，d，J＝8.2 Hz，H⁃7），7.19（1H，s，H⁃2），7.16（1H，t，J＝7.1 Hz，H⁃6），7.08（1H，t，J＝7.0 Hz，H⁃5），3.93（1H，dd，J＝4.8，8.1 Hz，⁃CH），3.38（1H，dd，J＝4.8，15.3 Hz，⁃CH2），3.19（1H，dd，J＝8.1，15.3 Hz，⁃CH2）；13C⁃NMR（D2O，125 MHz）δ：174.6（⁃CO），137.3（C⁃7a），126.6（C⁃3a），124.9（C⁃2），122.1（C⁃6），119.4（C⁃4），118.4（C⁃5），112.0（C⁃7），107.5（C⁃3），55.1（⁃CH），26.4（⁃CH2）。以上数据与文献［15］ 报道一致，故鉴定为色氨酸。

4 生物活性

4.1 分蘖洋葱乙醇提取物抑菌活性测试 培养基制备（PDA）为称取去皮土豆300 g，切碎加水400 mL 蒸煮30 min，用纱布过滤得澄清滤液，加入葡萄糖、琼脂粉各30 g，搅拌至充分溶解，定容至1 500 mL 然后分装到7 个250 mL 的三角瓶中，置于高压灭菌锅灭菌中灭菌30 min，待用。

分蘖洋葱乙醇提取物浸膏用甲醇溶解与PDA培养基按一定比例混匀（培养皿中分蘖洋葱乙醇提取物的质量浓度为5 mg／mL），作为处理组，加等同量甲醇的PDA 培养基作为对照组。用打孔器将番茄枯萎病病原菌的菌饼打成直径0.5 cm 的圆饼，接种在培养基上，置于28 ℃、相对湿度60%的培养箱中培养5 d 后观察其生长情况。结果，对照组长满了病原菌，处理组上的病原菌几乎没有生长，表明分蘖洋葱乙醇提取物能显著抑制番茄枯萎病病原菌的生长，在5 mg／mL 的质量浓度下，番茄枯萎病病原菌几乎不能生长。

4.2 各化合物抑菌活性测试 使用微量稀释法，通过96 孔细胞培养板完成4 个化合物对番茄枯萎病病菌的最低抑制浓度值（MIC）的测定。阳性对照药品为伏立康唑，称取20 mg，甲醇溶解制成2 mg／mL贮备液。

称量2 mg 刃天青粉末，制备成质量浓度为100 μg／mL 的指示剂，加入到96 孔酶标板的第11列孔中，将7 mL 质量浓度为143 μg／mL 的刃天青溶液和3 mL 含真菌的培养液混匀，使刃天青的最终质量浓度为100 μg／mL，分别往第1～10 列和第12 列的每个培养孔中加入100 μL，往每行的第一个孔中加入90 μL 100 μg／mL 刃天青指示剂和10 μL质量浓度为2 mg／mL 的化合物或阳性对照贮备液，混匀，从中取100 μL 溶液打到第2 个孔中，依此类推，一直到第10 个孔，最后移走100 μL。化合物和阳性对照贮备液的质量浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19 μg／mL，每个96 孔培养板的前6 行是化合物处理的，后2 行分别是含甲醇和伏立康唑的对照。最后，将培养板放在25 ℃培养箱中，直至第12 列培养液有蓝色变为粉红色，统计每个化合物的MIC值，整个过程约需要13～15 h。

结果，化合物1～2 对对番茄枯萎病病原菌具有较好的抑制作用，最低抑制浓度（MIC）分别为25.0、12.5 μg／mL，阳性对照伏立康唑的最低抑制浓度（MIC）为0.39 μg／mL，其他2 个化合物对番茄枯萎病病原菌生长无明显影响。

5 讨论

本研究从分蘖洋葱乙醇提取物中分离获得4 个化合物，发现1～2 对番茄枯萎病病原菌生长具有较好的抑制作用，可为分蘖洋葱的利用提供理论依据，并为合成新型除菌剂提供先导化合物。另外，番茄枯萎病为土传病害，分蘖洋葱与番茄间作能否抑制番茄枯萎病，分蘖洋葱根系分泌物中是否含有槲皮素及其具体含量尚不明确，还有待进一步研究。