鼻腔免疫疫苗的前景和未来面临的挑战

袁丽英，王娟，邓胜朝，李 菲，王贵平，贾爱卿

（广东海大畜牧兽医研究院，广州 511400）

与传统接种方式的疫苗相比，无针接种疫苗具有接种方便、成本低、易于管理和处理等优点。目前，有几种无针接种方法，如经皮接种和黏膜接种，其中黏膜接种已在人体成功地应用。许多黏膜通道，通常被认为是疫苗接种的潜在部位，如口腔、鼻腔、肺脏、结膜、直肠和阴道黏膜。出于理论和实践操作的原因，研究人员更倾向于关注口腔、鼻腔和肺脏途径给药。

生物机体拥有庞大的黏膜免疫系统，专门监视外来抗原，保护黏膜表面和机体免受其侵入，尤其是鼻腔黏膜系统是呼吸道系统的对外开放窗口。因为大多数感染是从黏膜表面开始的，所以通过鼻腔黏膜途径接种疫苗具有非常重要的意义。

1 鼻腔黏膜免疫系统

黏膜免疫活性与黏膜淋巴组织（mucosalassociated lymphoid tissue，MALT）有关。鼻腔黏膜免疫系统为机体提供局部保护，防止病原体经黏膜进入机体。黏膜免疫细胞游走于黏膜表面、上皮细胞和黏液物理阻隔病原侵入。

1.1 鼻腔黏膜的物理屏障系统 在病原侵入皮下组织时，上皮细胞和黏液起到物理屏障的作用。上皮细胞层覆盖在黏膜表面，是阻止病原侵入的黏液和纤毛的主要组成部分。此外，上皮细胞通过非特异性胞吞或受体介导（如Toll样受体，toll-like teceptors，TLRs）识别和吞噬病原体及抗原成分，或者仅识别抗原成分。上皮细胞与淋巴细胞、基础抗原递呈细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）、细胞因子和趋化因子一起，对接触的病原体或免疫物质产生非特异性和特异性免疫应答。

1.2 鼻腔黏膜活化的免疫系统 鼻咽淋巴组织（nasopharynx-associated lymphoid tissue，NALT）是鼻黏膜上活跃的黏膜免疫系统，该系统由淋巴组织、B细胞、T细胞和抗原递呈细胞组成，并覆以含有记忆细胞（M细胞）的上皮层。每当病原或抗原组分接触到鼻黏膜时，即会激活黏膜免疫系统。病原体或免疫原通过鼻腔黏膜和相互作用的抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APCs）（如：巨噬细胞、树突状细胞等）时被识别，他们游走于鼻腔黏膜表面保护免疫系统。这些抗原递呈细胞将抗原运送到淋巴结，淋巴结将抗原呈递给T细胞，这标志着免疫级联反应被激活。可溶性抗原可被APCs识别，而颗粒抗原通常被M细胞吸收后被运输到NALT。

1.3 鼻腔黏膜的免疫抗体免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA） 鼻腔黏膜免疫系统产生的IgA，是免疫反应中的一种重要的抗体，其主要存在于支气管的黏液中。而大部分IgA位于外分泌液中，被称为分泌型的IgA（secretory IgA，sIgA）。黏膜分泌的IgA，具有多种防御功能，如吸附黏液中的抗原或毒素，阻止他们直接接触黏膜表面。此外，sIgA还可以阻断致病分子与上皮细胞的附着，在浆细胞和上皮细胞共同作用下，使得IgA在黏膜区域具有主导性优势[1]。

2 鼻腔免疫系统的主要结构及作用

鼻腔直接与外界连通，主要负责调节空气流量。因鼻腔是许多病原体的主要入口，通过鼻腔接种疫苗为机体免疫提供了一条便捷的途径。鼻腔的第一道保护屏障是鼻孔入口处的鼻毛，能够完全挡住较大的颗粒。鼻腔的整个表面覆盖着一层黏液层，鼻腔分泌的黏液中含有多种类型的黏液素，可以吸附较小的颗粒。当黏膜表面的纤毛通过以每分钟5～6毫米的速度摆动，可以将病原体通过打喷嚏和或咳嗽咳痰的机械方式清除，或者通过含有黏液素的黏液层输送到咽喉后部，进入胃中的病原体被消化，此功能最大程度减少病原粒子进入黏膜表面。

鼻腔上皮包裹着毛囊相关的淋巴组织，这些淋巴组织在诱导黏膜免疫反应中起着重要作用。免疫细胞（如附近的B淋巴细胞）可以在呼吸道病原体侵入的黏膜部位产生IgA。基于鼻腔的结构特点，已有预防呼吸道感染和性传播疾病的疫苗通过鼻腔途径进行接种免疫，可有效预防治疗相应的疾病[2]。

3 现有的鼻腔疫苗制品

3.1 预防性鼻腔免疫疫苗

3.1.1 使用于人类的鼻腔疫苗 目前经批准的人类鼻腔接种的疫苗包括流感疫苗FluMist/FluenzTM（MedImmune，MD，USA）和印度血清研究所生产的鼻用减毒流感活疫苗（NasovacTM）。FluMist（鼻内流感疫苗）被认为是最成功的鼻内免疫疫苗之一，具有良好的耐受性并且表现出良好的疗效[3]。尽管目前还没有足够的数据表明NasovacTM的安全性，但也没有关于使用NasovacTM相关的严重副作用报道[4]。

人类使用的鼻腔免疫疫苗结合相应的给药设备会增加疫苗的免疫效果。如MucoTM系统的网站展示了鼻腔流感疫苗在非人类灵长类动物上的免疫原性研究，数据表明，与注射和鼻腔液体喷雾相比，MucoTM系统在黏膜中产生了更多的sIgA（比液体喷雾的高了4倍）[5]。

3.1.2 使用于动物的鼻腔疫苗 目前商品化鼻腔免疫疫苗较多使用在禽类，如已在临床应用多年的新城疫疫苗和传染性法氏囊疫苗，采用滴鼻进行黏膜免疫[6]。用猪伪狂犬病病毒活疫苗对1～3日龄乳猪喷鼻免疫，是猪场净化猪伪狂犬病的第一步，能有效抵御伪狂犬病野毒的入侵。由于伪狂犬病病毒主要定植在三叉神经，使用gE缺失的弱毒疫苗可以在黏膜表面占位，从而抵抗野毒的感染。同时，黏膜免疫可以避免母源抗体对免疫产生的影响。猪繁殖与呼吸综合征活疫苗与LT蛋白通过滴鼻免疫小鼠，可产生理想的黏膜免疫应答及系统的体液免疫和细胞免疫反应[7]；鸭瘟活疫苗滴鼻诱导的黏膜免疫效果与肌注免疫效果同等[8]；重组刚地弓形虫抑制蛋白滴鼻免疫小鼠可诱导脾淋巴细胞增殖和Th1型细胞免疫应答[9]。在人和其他动物上，鼻腔免疫的疫苗研究也越来越广泛。

3.2 治疗性鼻腔免疫疫苗 虽然目前针对鼻腔疫苗研究多集中在预防性疫苗上，但经鼻腔免疫疫苗也被用于治疗疾病。目前，引起更多关注的是鼻腔免疫疗法治疗人的各种癌症和阿尔茨海默病，以及使用治疗性疫苗治疗自身免疫性疾病（如Ⅰ型糖尿病、动脉粥样硬化、多发性硬化、类风湿性关节炎、红斑狼疮和克罗恩病[10]）。这种家族疾病的治疗通常是非特异性的，或者使用免疫抑制剂来降低对感染的易感性。有效的治疗性疫苗可调整机体对自身抗原的耐受性，避免不良免疫反应。近期研究表明鼻腔免疫疫苗通过激活引流淋巴结中的树突状细胞来增强Foxp3+T细胞的诱导能力也可以实现类似的耐受性诱导[11]。

目前在人体上经鼻腔接种成功的案例有动脉粥样硬化和关节炎的治疗。而在动物生产中，黏膜免疫疫苗如猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）、传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis of pigs virus，TGEV）、轮状病毒疫苗等正处于体外试验研究阶段，即将应用于临床[12]。

4 鼻腔疫苗免疫的前景

4.1 鼻腔免疫系统活跃，提升免疫效率的潜力大 鼻腔内的淋巴组织在诱导黏膜免疫反应中起着重要作用。同时免疫细胞（如附近的B淋巴细胞）可以在病原体侵入呼吸道黏膜部位时产生IgA。因此鼻腔接种的疫苗不但可诱导血清产生IgG，而且还诱导黏膜分泌IgA，这对于提升疫苗的免疫效力很重要。在中和肺炎链球菌和麻疹病毒等病原体和防止进一步感染方面，鼻腔接种疫苗可增强诱导黏膜产生IgA具有重要作用[13]。

4.2 鼻腔疫苗免疫可降低接种成本 鼻腔内免疫可同时诱导系统和黏膜免疫应答，产生交叉免疫保护效应，利用该效应可以减少所需疫苗的数量，从而降低生产多种抗原的成本，同时也提高了鼻腔疫苗的免疫效力，这是鼻腔免疫疫苗较其他免疫方式的明显优势所在。

其次，接种方法较注射免疫操作简单，无需接种针头，更容易被接种对象接受，不良反应少，接种成功率较高，损耗成本降低，也间接降低了疫苗免疫成本。

4.3 鼻腔疫苗的免疫效率高 鼻腔粘膜免疫可以避免胃肠道降解和肝脏首过效应，具有生物降解低，粘膜表面吸收快，可迅速引起免疫反应，利用率高，患者顺应性强。同时通过鼻腔给药可提高药物在脑组织的分布，治疗中枢神经系统性疾病。

5 鼻腔免疫疫苗面临的挑战

5.1 科学合理的鼻腔疫苗剂型 目前的鼻腔免疫疫苗剂型有溶液（液滴或气雾剂）、粉末、凝胶和固体填充物。选用科学合理的剂型对于鼻腔疫苗的接种至关重要。以下是目前常用的疫苗剂型，不同剂型在免疫过程中存在不同的优缺点。

5.1.1 溶液制剂 常见的溶液型的鼻腔疫苗，是体内研究或临床试验中最简单的疫苗制剂方法，也最容易接种，但人或动物接种疫苗时，必须躺下或把头后仰一段时间，这在大规模疫苗接种时是不现实的。喷雾剂型更容易接种，也易于疫苗深入鼻腔。不过，有可能会从鼻孔泄漏或流进口腔，另外液体剂型较容易降解。

5.1.2 固体制剂 常见的固体剂型如粉末或固体填充剂，其优点包括易于制造和稳定。但由于疫苗通常只接种一到两次，不像定期服用的药片需要长期服用。一部分固体填充剂被设计成片剂，一接触到黏膜即溶解。这种剂型已被广泛应用于人类阴道给药和家畜鼻腔给药，与舌下含服剂型有诸多相似之处[14]。

5.1.3 粉末制剂 粉末状疫苗的优点是比液体形态具有更好的稳定性，能够靶向鼻腔深部。例如，炭疽干粉雾化疫苗已在发达国家和发展中国家大规模使用[15]。粉末剂型的劣势主要是成本问题，因为需要专门设备进行接种。

5.1.4 颗粒制剂 目前有更多的证据支持这样的假设，即小于300 nm的粒子穿过黏液的效率最高，但也有证据表明较大的粒子也能够穿透[16]。对接种鼻腔内凝胶微粒的研究结果表明，整个颗粒的渗透可能不是诱导免疫应答所必需的。颗粒的大小和所带电荷的全面组合，也许是实现最好免疫效果的关键[17]。可溶性抗原的免疫原性往往低于颗粒制剂，但抗原包囊可加速抗原透过鼻腔黏膜。因此，研发疫苗微粒载体系统受到极大青睐。

在研制新疫苗时，剂型和接种方式非常重要，这是为了有效地诱导针对靶病原的先天免疫应答和适应性免疫应答。可模拟病原体的微粒接种系统（纳米粒聚合物和脂质体），被认为是一种很有前途的鼻腔疫苗接种方法。

目前被用于鼻腔疫苗的颗粒制剂的凝胶剂，是一系列天然、合成和半合成的聚合物。含有凝胶吸附剂（或有粘性或可以透过黏膜粘液）的制剂能够延长疫苗释放的时间。虽然关于正电荷或阴离子聚合物能否促进更好的吸收尚存在争议，但用凝胶缓释给药可以改善疫苗作用时间毋庸置疑。Jesus等[18]研究表明，能粘附在黏膜表面并可选择性靶向M细胞或APCs细胞的凝胶是最有效的。

5.2 有效的疫苗佐剂 佐剂是由添加的一些材料将抗原形成凝胶或颗粒的形式，或作为单独的组分添加到疫苗产品中，是非特异性免疫增强剂，其可以减少免疫应答所需的抗原量。传统疫苗常用的氢氧化铝佐剂，在黏膜接种免疫时无效。颗粒输送系统被认为既有利于优化通过黏液或黏膜组织的输送，又起到内在的辅助作用。如前所述，选择合适的佐剂是提高免疫效力的有效手段。

经验证的鼻腔黏膜接种疫苗所用佐剂包括：MF59乳剂（含角鲨烯油、司班85、吐温80和柠檬酸缓冲液）、脂多糖、TLR激动剂（toll-like receptor，TLR）、壳聚糖、三甲基壳聚糖、细菌外膜蛋白和霍乱毒素或大肠杆菌不耐热肠毒素（heatlabile enterotoxin，LT）等。但研究发现，在鼻内接种以细菌毒素为佐剂的疫苗时会引起一些副作用，如面部神经麻痹（俗称贝尔麻痹）和其他与面部神经紊乱，因此，LT不再被推荐使用作为人用疫苗的佐剂。肥大细胞活化剂如化合物C48/80等在炭疽疫苗中显示了良好的佐剂作用。佐剂具有双面性，在考虑特定疫苗类型的佐剂时，也应考虑其带来的不良反应。例如，用含TLR-4增强剂的流感疫苗经鼻腔接种小鼠，其IL-17A病理症状表现为短暂增强，同时体重减轻和发病率特征明显高于不含佐剂组的小鼠[19]。在佐剂选择中还应注意佐剂对诱导耐受性的影响，Zonnveld-Huijssoon等[20]的报道表明，通过鼻内联合接种卵溶菌酶和TLR2配体增强了机体的Th1型抗体，TLG2配体PAM3cys增加了自身免疫性疾病的风险。

5.3 大动物鼻腔疫苗的推广普及 通过鼻腔免疫途径接种疫苗，不但可以阻止条件性致病菌及外源性病原微生物在黏膜上皮定居、繁殖，还可以阻止病原微生物释放的毒素及代谢产物损害机体细胞引起病理性损伤，可有效地预防一些人及畜禽传染病的发生。

FluMist®重组减毒活疫苗已被人们广泛应用，在禽类鼻腔疫苗免疫也早已应用[21]。但对于体格较大的动物，鼻腔疫苗的普及应用仍面临较大的挑战，需要克服疫苗免疫时动物的不配合，也需要考虑在大面积疫苗接种时，对应接种疫苗的辅助设备以及接种者易接受度。

6 小结与展望

本文主要叙述鼻腔接种预防性疫苗，及鼻腔接种疫苗在疾病治疗过程中发挥的作用。目前，本文所述的许多制备方案在人或动物上尚未建立安全规范文件。但越来越多的临床试验表明，基于疫苗生产成本和接种可操作性等方面考虑，鼻腔免疫比其他黏膜免疫途径更有优势，因此迫切需要鼻腔接种疫苗产品。就目前生产的鼻腔免疫疫苗产品免疫效果来看，直接刺激黏膜免疫反应的优势是显而易见的。伴随着免疫需求的增加，尤其对禽流感、猪流感和埃博拉等传染病，如何快速产生免疫应答的需求增加，亟需制定相应的解决对策；更亟需对制剂或载体与佐剂之间在诱导免疫应答中的相互作用机理的研究。