靶向老化细胞的延衰新策略

祁均梅 杨凯业 林豪杰 许诺 丁明 胡振林

(1温州大学生命与环境科学学院，浙江 温州 325035；2无限极(中国)有限公司；3温州大学生命科学研究院)

衰老是许多常见疾病包括癌症、心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病等的主要危险因素。了解衰老的机制并加以针对性的干预，有助于衰老相关疾病的防治，但衰老的生物学机制极其复杂，迄今尚未阐明。较早的抗衰老策略主要基于抗氧化应激，但膳食补充抗氧化剂临床试验并没有给出明确的结论。其他的抗衰老策略如热量限制(CR)，虽然实验依据充分，但只能在动物身上有效地实施，难以在人体中有效进行。近年来随着对衰老机制研究的不断深入，出现了多种新的抗衰老策略，包括靶向调控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、去乙酰化酶(Sirtuin)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等控制衰老进程的信号通路、诱导自噬、激活端粒酶、激活质膜氧化还原系统、表观遗传学调控、干细胞疗法等。本文对细胞老化导致机体衰老的机制及针对老化细胞延衰策略的最新研究进展进行综述。

1 老化细胞在体内的堆积是机体衰老的重要因素

机体衰老通常伴随着皮肤衰老、行动变得迟缓、听觉嗅觉的消退等特征。在分子及细胞水平上，衰老的特征包括基因组的不稳定性增加、端粒损耗、线粒体功能失调、营养状况感应失调、蛋白质稳态丧失、细胞间通讯改变、细胞老化和组织再生能力减弱等〔1〕。细胞老化与机体衰老有着十分密切的联系〔2〕。

细胞老化可由端粒缩短、DNA损伤、氧化应激、线粒体功能障碍及其他衰老相关因素诱发。长期的细胞周期阻滞是老化细胞的最基本特征〔3〕，主要表现为G1 期阻滞，在个别情况下也可伴随着G2/M期周期阻滞，或由G2/M期阻滞诱发形成〔4，5〕。除增殖停滞外，老化细胞会持续表达一系列促炎细胞因子、趋化因子、生长因子及基质金属蛋白酶(MMP)等，称为老化相关的分泌表型(SASP)。介导细胞老化的信号通路主要是p53/p21CIP1和p16INK4A/Rb通路〔6〕。p53和p16INK4A作为细胞老化过程中的关键节点，能感受细胞内众多应激压力的改变而被激活，如原癌基因的异常表达、端粒功能异常、DNA损伤和活性氧(ROS)的累积等〔7〕。在p53所调控的众多下游基因中，p21CIP1在细胞老化中的作用最为突出，它不但可抑制周期蛋白依赖性激酶(CDK)1进而诱使细胞发生G2/M期阻滞，还可以抑制CDK2和CDK4的活性，降低Rb磷酸化水平，使细胞无法进入S期〔8〕。在老化细胞中，非磷酸化的Rb聚集在E2启动结合因子(E2F)1上，阻止E2F1下游促增殖靶标基因的转录，是细胞老化过程中另一重要的信号节点〔9〕。p16INK4A则通过与CDK4 和CDK6结合，阻滞其与CyclinD结合，抑制CyclinD-CDK复合物的活性，抑制有丝分裂原刺激诱导的Rb蛋白磷酸化，使细胞阻滞在G1期，从而维持衰老细胞不可逆的生长停滞状态〔10〕。

细胞老化对机体具有正反两方面的作用。在年轻的生物体内，细胞老化可阻止受损细胞的增殖，从而防止其进一步癌变。同时，年轻生物体内强大的免疫系统可识别并及时地清除掉老化细胞，防止老化细胞的积累。另一方面，随着机体衰老，端粒不断缩短，DNA暴露于各种诱变剂的机会增多，病毒DNA整合进入基因组的概率也增加，造成越来越多的细胞进入老化状态，同时机体免疫系统功能也逐渐衰退，导致大量的老化细胞不能被及时清除而在体内聚集积累，从而对组织稳态产生毒性效应，进而促使衰老。如在对小鼠进行基因突变诱导早衰时，发现其老化细胞数量迅速增加，而若敲除其体内p16INK4a或p53基因，则早衰表型有所减轻，说明两者通过诱导细胞老化以促进病理性衰老〔11，12〕。

老化细胞对机体的正反两方面的影响在很大程度上是由于其老化相关的分泌表型(SASPs)。老化细胞所分泌的SASP因子由一百多种不同的分泌蛋白组成。一方面，SASP因子可募集自然杀伤细胞和巨噬细胞等免疫细胞，有助于清除老化细胞和邻近的肿瘤细胞，即所谓的老化细胞免疫监督功能〔13〕，而且在创伤修复过程中，SASP因子可促进修复或限制修复所致的过度纤维化，促进伤口愈合〔14〕。另一方面，持续释放的SASP因子会导致低水平的炎症反应，引起组织结构的改变和功能的丧失，并引发一些跟衰老相关的慢性疾病，如SASP因子中的血管内皮生长因子是直接促成黄斑变性的病理性原因〔15〕；MMP-3和白细胞介素(IL)-6与骨关节炎有关〔16〕。老化皮肤细胞所分泌的 SASP因子的重要组成成分MMPs能降解几乎所有的细胞外基质，包括胶原蛋白、弹性纤维、蛋白聚糖、纤维粘连蛋白和板层素胶原纤维等，这些变化使得皮肤的支撑结构丧失，皮肤弹性下降，导致老化皮肤松弛和皱纹形成〔17〕。

2 靶向清除老化细胞或抑制其SASP表型具有显著的延衰作用

在不同的组织器官中，老化细胞会随着年龄的增加而积聚，且由于老化细胞持续释放的SASP因子会影响到周围组织的结构和功能，因此老化细胞的积累是衰老及相关疾病的重要病理基础，而靶向清除老化细胞能有效地改善老年机体的衰老症状〔18，19〕。

2.1选择性老化细胞溶解剂-Senolytics的延衰作用 老化细胞之所以能够在增殖停滞状况下持续存活而不发生死亡或凋亡，主要是由于其细胞内的促存活或者抗凋亡信号通路过度活化所致，包括Ephrin(EFN)B 、B细胞淋巴瘤超大蛋白(Bcl)-xl、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、p21WAF1、纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)-2等信号通路〔20〕，因此这些信号通路的抑制剂有可能选择性地诱导老化细胞凋亡，进而溶解老化细胞〔21〕，而这些能够选择性诱导老化细胞溶解的药物就被称为Senolytics。Ephrin B抗凋亡通路的抑制剂达沙替尼是第一个被发现的Senolytics，Zhu等〔20〕研究发现达沙替尼与槲皮素(PI3K通路抑制剂)联合使用可选择性地诱导老化细胞凋亡，有效减缓衰老小鼠模型的衰老进程，延长治疗小鼠的寿命。随后，多种Senolytics被发现，如Zhu等〔22〕发现Navitoclax能抑制Bcl-2、Bcl-w及Bcl-xl活性，进而阻止老化细胞继续存活。Baker等〔18〕发现，在转基因INK-ATTAC快速衰老小鼠模型中，使用小分子AP20187通过膜结合的肉豆蔻酰化FK506结合蛋白(fkbp)-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)8二聚反应诱导老化细胞凋亡，清除p16阳性的老化细胞，可使小鼠年轻6个月，相当于人类年轻数十年。Baar等〔19〕用小干扰RNA(siRNA)敲减p53的抑制蛋白叉头框转录因子(FOX)O4或者以小肽阻断FOXO4与p53的结合从而激活p53的促凋亡活性，发现能选择性地诱导老化细胞凋亡，体内给予这种老化细胞凋亡诱导肽能显著改善快速衰老转基因小鼠和自然老化小鼠的衰老症状，包括肾功能和毛发密度等，并且没有产生任何不良反应。迄今，已经报道的Senolytics已累计十几种，包括小分子、抗体和多肽等。这些新的研究表明机体组织器官的衰老与老化细胞的堆积直接相关，而靶向清除这些老化细胞具有显著的延衰作用，甚至可使机体年轻化。值得注意的是，每种Senolytics只对特定组织来源的老化细胞有效，因此针对不同的老年疾病，可能需要不同类型的Senolytics。与其他的延衰策略相比，直接靶向清除老化细胞存在以下优势：理论上只需定期应用Senolytics清除衰老细胞即可起到延衰作用，可减轻或避免不良反应的产生；与癌症治疗不同，衰老相关疾病防治无需清除组织中所有的老化细胞，动物研究表明〔23〕，清除部分老化细胞就足以产生显著的抗衰老效应；Senolytics只影响已存在的老化细胞，而不会影响这类细胞的形成，这意味着老化细胞本身所具有的肿瘤抑制功能仍可保留。

2.2抑制SASP表型也可产生延衰作用 由于老化细胞对机体的不良作用主要由其分泌的SASP因子所介导，因此抑制老化细胞的SASP表型也可能产生延衰效应。有研究表明，老化细胞的SASP表型与多条信号通路的过度活化有关，包括p38 MAPK、MK2〔24〕激酶、核因子(NF)-κB〔25〕、IL-1A〔26〕、CAAT增强子结合蛋白(C/EBP)β〔27〕、Sirt1〔28〕及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化还原平衡〔29〕等。已经报道一些植物天然化合物能通过抑制上述信号通路来抑制老化细胞的SASP表型，如NF-κB通路抑制剂包括芹菜素(apigenin)、汉黄芩素(wogonin)等〔25〕，IL-1A信号通路抑制剂雷帕霉素(rapamycin)〔26〕及Sirt1激活剂白藜芦醇(resveratrol)〔30〕均能通过抑制老化细胞的SASP表型来发挥一定的延衰作用。

3 增强免疫系统的免疫监督功能是靶向清除老化细胞的潜在途径

老年机体内的老化细胞之所以能持续存在，一定程度上是由于老年机体的免疫系统机能降低，不能及时清除不断形成的老化细胞所致。其实，在年轻机体组织中老化细胞也会不断产生，但可被免疫细胞及时清除，因此老化细胞不会堆积。但老年机体免疫力下降，不能及时清除老化细胞，致使老化细胞不断堆积。

正常生理情况下，机体的免疫细胞能够识别并及时清除老化细胞，以维持内环境的稳定，免疫系统的该项功能被称为老化细胞免疫监督功能〔31〕。执行该功能的免疫效应细胞包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞等天然免疫细胞和细胞毒性T淋巴细胞等特异性免疫细胞〔31〕。NK细胞是目前最为明确的执行老化细胞免疫监督功能的非特异性免疫细胞，在NK细胞和诱导老化的肺成纤维细胞共培养系统中，可直接观测到NK细胞对老化细胞的选择性杀伤作用〔32〕。NK细胞最早被发现能以不依赖主要组织相容性抗原的方式杀伤肿瘤细胞和感染了病毒的细胞，因此一直被认为是机体免疫防御的第一道重要防线。随后研究发现许多细胞在应激状况下都会上调一些应激蛋白如主要组织相容性复合物Ⅰ类相关链(MIC)A和UL16结合蛋白(ULBP)2的表达，而这些应激蛋白可被NK细胞表面的NK细胞活化性受体2群成员(NKG2D)受体识别，进而介导NK细胞对应激细胞的清除。最近的研究发现老化细胞也会高表达这些应激蛋白并被NK细胞的NKG2D受体识别，进而以颗粒胞吐作用的方式杀灭老化细胞〔33〕。在小鼠肝纤维化模型的实验研究中，NK细胞颗粒胞吐作用的缺陷和NKG2D的基因敲除均会导致老化的星状细胞在肝脏的堆积和肝纤维化的加剧〔33〕。

除NK细胞外，巨噬细胞在老化细胞免疫监督中的作用也引起了越来越多的关注〔31〕。巨噬细胞是功能强大的吞噬细胞，体内实验研究表明巨噬细胞和NK细胞一样能够被募集至老化细胞周围，并介导对老化细胞的清除。耗竭小鼠体内的巨噬细胞会导致老化细胞免疫监督功能极大地削弱，致使老化细胞的堆积，在老化细胞和巨噬细胞的体外共培养系统中，老化细胞能够影响巨噬细胞的激活状态，进而诱导其靶向杀伤老化细胞〔34〕。巨噬细胞识别老化细胞的机制可能与其识别凋亡细胞的机制类似，凋亡细胞会表达一些特定的细胞表面抗原作为“eat me”信号，被巨噬细胞的清除剂受体识别，介导其对凋亡细胞的吞噬清除。与之类似，老化细胞也会特异表达某些表面抗原，包括氧化修饰的膜蛋白vimentin和氧化修饰的脂质等，其可作为模式识别配体被巨噬细胞的清除剂受体CD36和晚基糖基化终产物受体(RAGE)等识别，介导其对老化细胞的吞噬清除〔31〕。随着年龄的增加，上述免疫细胞的迁移能力和杀伤靶细胞的功能会逐渐减弱，因此不可避免地导致老化细胞在体内堆积，进而导致组织器官的功能衰退。鉴于免疫细胞在靶向清除老化细胞中的重要作用，免疫增强策略将有利于靶向清除老化细胞以延缓衰老和缓解老年相关的疾病。这一概念近年来已经取得了一些实验证据的支持，如在肝纤维化小鼠实验中，给予免疫激活剂能够加强NK细胞介导的老化星状细胞的清除，缓解模型小鼠的肝纤维化〔35〕。

综上，与延长寿命相比，发展病理性衰老的防治方法更加有益。细胞老化与机体衰老的关系非常密切，而靶向老化细胞的抗衰老策略有望成为安全高效的延衰新策略，该策略主要包括应用Senolytics直接清除老化细胞、抑制老化细胞的SASP表型和增强免疫系统的老化细胞免疫监督功能促进其间接清除老化细胞等方法。尽管在动物实验中取得了很好的延衰效果，该策略在应用于人类之前还需要大量长期的临床研究。