基因启动子甲基化与口腔鳞癌的研究进展*

贾玉良 综述，陈 彬，梁文红 审校

(1.遵义医科大学，贵州遵义 563000；2.遵义医科大学附属口腔医院，贵州遵义 563000；3.贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州遵义 563000)

口腔鳞癌(OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)发病率的90%，OSCC病死率高，5年生存率约50%，每年新增病例超过28万例，其中很大一部分发生在中国[1]。OSCC的发生是一个受内源性因素和环境因素调控的多步骤过程，其中长期烟酒摄入是两个主要的危险因素，而慢性炎症、人类乳头瘤病毒(HPV)持续感染、咀嚼槟榔和遗传易感性是其发病机制的辅助因素，这些易感因素可能导致广泛的遗传和表观遗传改变，包括异常的DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNAs表达的改变，这些改变促进了基因组的不稳定和肿瘤的发展[2]。对于目前的治疗策略，外科手术辅以放疗或化疗仍是OSCC的主要治疗方法。近年来，虽然OSCC治疗策略的进展提高了部分患者的疗效，但预后仍不理想。因此，深入了解OSCC的发病机制，将有助于评估OSCC的进展和预后，可为OSCC的分子靶向治疗提供新的思路。

1 基因启动子甲基化的表观遗传修饰

表观遗传修饰是指在无DNA序列改变的情况下，基因表达中任何可遗传的改变。目前已知的表观遗传机制有3种主要类型:DNA甲基化、组蛋白修饰和核糖核酸干扰(RNAi)，任何一种表观遗传机制的破坏都会导致基因表达失调，从而促进癌症和其他表观遗传病的发展。DNA甲基化是最常见也是研究最深入的表观遗传修饰，其是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基，在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下，共价结合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位上的过程。CpG二核苷酸是发生DNA甲基化的主要位点，分散在整个基因组中的CpG二核苷酸通常聚集在0.50～4.00 kb的区域，该区域称为CpG岛，其主要部分位于肿瘤抑制基因的启动子上[3]。启动子区CpG岛发生异常高甲基化可导致肿瘤抑制基因的转录沉默，从而促进癌症进展。研究表明，启动子区CpG岛的差异甲基化表型可能是OSCC发展的早期事件[4]。此外，某些基因的甲基化状态，包括死亡相关蛋白激酶(DAPK)1、Dickkopf相关蛋白3(DKK3)、大肿瘤抑制因子2(LATS2)等，有望成为OSCC早期检测的生物标志物。因此，有必要进一步探讨启动子的甲基化状态与OSCC相关基因表达间的相关性。本文就近5年研究热门的6个OSCC基因启动子甲基化的相关进展进行综述，以期为临床防治OSCC提供帮助。

2 OSCC相关启动子甲基化基因

2.1 DAPK1

DAPK家族包含5个成员即DAPK1、DAPK2、DAPK3、DRAK1和DRAK2，其中研究最广泛的成员是DAPK1，DAPK1是1个160×103的细胞骨架相关蛋白激酶，由1 430个残基组成，被位于5号染色体上的DAP基因所编码，属于钙/钙调蛋白(Ca2+/CaM)调控的STK的超家族。就其大小而言，为该家族中最大的成员，并且以其作为强大的肿瘤抑制因子及细胞凋亡和自噬的调节剂而闻名，因此，与其他成员相比，DAPK1获得了更多的科学关注。近期有研究表明，在大多数的癌症中，DAPK1的表达因启动子区CpG岛高甲基化而出现下调，从而导致了癌细胞增殖[5]。CHEN等[6]研究发现，DAPK1基因启动子中包含1个CpG岛，其高甲基化可导致基因沉默，同时，包括OSCC在内，已经有多种类型的癌症检测到了DAPK1在CpG岛上发生甲基化。此外，BHAT等[7]通过亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)检测发现，DAPK1启动子序列在肿瘤组织中的甲基化程度明显高于匹配的正常组织。同样，在一项病例对照研究中发现，DAPK1启动子甲基化与OSCC呈明显相关[8]。上述多项研究表明，DAPK1基因启动子高甲基化可作为OSCC检测的1个有前景的生物标志物。

2.2 DKK3

DKK3是Dickkopf Wnt信号通路抑制剂家族的最新成员，其分子量为38×103。该家族包含具有两个不同的富含半胱氨酸结构域的分泌蛋白，拮抗Wnt配体，从而充当致癌Wnt信号传导的负调节剂，然而，DKK3蛋白并不拮抗Wnt蛋白，其机制目前尚不清楚。有研究表明，DKK3能有效抑制多种肿瘤的生长，其表达水平可通过DKK3启动子基因的超甲基化下调[9]。ZHOU等[10]通过免疫组织化学(IHC)染色和半定量RT-PCR检测DKK3在正常口腔和OSCC组织中的蛋白和mRNA水平的表达，发现DKK3在OSCC组织中表达较强。且在OSCC中，DKK3基因表达下调由启动子区的CpG岛甲基化引起。张素欣等[11]应用RT-PCR及甲基化特异性PCR(MSP)的方法，分别检测OSCC组织和正常口腔黏膜组织中的DKK3基因启动子区的甲基化状态，发现OSCC组织中DKK3基因启动子区甲基化状态明显高于相应正常口腔黏膜组织，提示DKK3基因启动子区的高甲基化状态可能是OSCC发病的重要机制之一。有研究通过建立DKK3过表达模型，将表达质粒转染到OSCC来源的细胞系中，发现过表达的DKK3导致了癌细胞增殖、迁移和侵袭增加，而这种表达下调或丢失主要是由CpG岛甲基化引起[12]。因此，基于这些研究结果，表明DKK3可成为OSCC早期检测的一个潜在的肿瘤标志物。

2.3 LATS2

LATS2是Hippo信号通路中重要的调控因子，人体内Hippo信号可以通过负性调控其下游的转录共激活因子Yes相关蛋白(YAP)发挥作用。LATS2基因位于人类染色体13q11-q12，负责编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，定位于中心体，通过积累微管蛋白和纺锤体的形成来调控细胞周期而发挥抑癌基因的作用。有研究发现，过表达的LATS2基因可明显抑制OSCC细胞增殖并促进细胞凋亡[13]。LADIZ等[14]采用RT-PCR及MSP方法，分别对OSCC组织和正常口腔组织中的LATS2基因启动子区的甲基化状态进行评估，结果显示，与正常口腔组织相比，OSCC组织中LATS2基因通过启动子的甲基化而出现下调。韦存志等[15]研究发现，OSCC组织LATS2基因启动子区甲基化发生率明显高于癌旁正常组织，且LATS2基因启动子甲基化与LATS2 mRNA表达呈负相关关系，提示LATS2基因启动子甲基化致其基因表达受到抑制可能是OSCC的发病机制之一。文献[13,16]研究也发现，OSCC中LATS2基因低表达与LATS2基因启动子甲基化水平明显相关，提示LATS2基因启动子高甲基化导致LATS2表达下调可能是OSCC的一个发生因素。DONG等[17]证实了过表达的LATS2可以抑制OSCC的细胞增殖、克隆形成和细胞侵袭。因此，LATS2可能在OSCC的发生、发展中起一定作用，可成为OSCC治疗的潜在靶点。

2.4 婆罗双树样基因(SALL)2

SALL2又称SPALT样转录因子2，是参与发育和进化过程中保守的SALL转录因子家族成员，该基因位于人类染色体14q11.10-q12.13。SALL蛋白的特征是沿着它们的序列存在锌指基序，像SALL家族的其他成员一样，SALL2亚型在整个蛋白质中都有一个C2HC型的N端锌指结构域、一个富含谷氨酰胺的区域和几个C2H2型的双锌指和三锌指。此外，SALL2含有谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸富集区，这些区域通常存在于转录因子上。有研究表明，SALL2在多种癌症中表达下调[18]。SUNG等[19]研究证明，SALL2的P2启动子(包含1个功能性CpG岛)在大多数原发性肿瘤中被高度甲基化。IMAI等[20]通过研究SALL2启动子的甲基化状态，发现OSCC细胞系中SALL2的标准化甲基化值明显高于正常细胞系，以上研究表明，CpG位点高甲基化可能是SALL2失活的机制之一，SALL2高甲基化可能在OSCC的发生中起一定作用，并可作为重要的临床风险评估指标。汪聪等[21]应用qRT-PCR法检测口腔组织中SALL2 mRNA的表达，发现过表达的SALL2基因可降低OSCC细胞增殖、迁移能力，且SALL2在OSCC组织中的表达明显低于正常口腔组织。因此，进一步分析SALL2将有助于明确其在OSCC中的生物学作用，以及作为早期检测和预后标记物的应用价值。

2.5 双肾上腺素样激酶1(DCLK1)

DCLK1是蛋白激酶超家族和双皮质素(DCX)家族的成员，基因定位于人类染色体13q13。DCLK1的结构特点是N末端结构域与DCX具有很高的氨基酸序列同源性(约70%)，其N-末端区域包括串联的双皮质域(DCX1和DCX2)，具有驱动微管结合功能，而C-末端区域包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，该结构域与Ca2+/钙调蛋白依赖蛋白1(CaMKI)激酶结构域高度相关。有研究显示，DCLK1基因启动子甲基化在多种肿瘤中异常，与肿瘤的发生和发展密切相关[22]。张建丽等[23]选取手术切除的OSCC组织和对应的癌旁组织,采用MSP检测DCLK1基因启动子甲基化情况,结果显示OSCC组织中DCLK1基因启动子甲基化阳性表达与DCLK1 mRNA及蛋白表达之间均呈负相关，并且DCLK1基因启动子甲基化状态与患者临床病理特征及预后相关,提示DCLK1可能成为评估肿瘤侵袭或转移的有效指标。KADLETZ等[24]通过使用标准的IHC技术来评估DCLK1的表达，结果显示有54.30%的OSCC患者表达了DCLK1。因此，DCLK1基因启动子甲基化可能成为评估肿瘤侵袭或转移的有效指标，可为OSCC的治疗提供一种新思路。

2.6 KN基序和锚蛋白重复结构域(KANK)1

KANK1属于KANK家族的一员，该基因位于染色体9p24.30，有一定的生长抑制作用，并可破坏β-肌动蛋白的分布。KANK1的蛋白结构由N-末端的KN基序、保守的中心卷曲螺旋结构域和C-末端锚蛋白(ANK)重复域3个部分组成，其可通过这3种蛋白区域结合各种靶蛋白发挥生物学作用。有研究发现，KANK1作为一种候选的抑癌基因，在多种癌组织中低表达甚至不表达，其原因主要是启动子区发生了异常高甲基化[25]。FAN等[26]通过检测OSCC和正常组织中KANK1启动子区域的甲基化水平，发现OSCC组织中KANK1启动子区甲基化频率明显高于相应正常口腔组织中的甲基化频率，且KANK1在OSCC组织中的表达较低。薛晓寒等[27]采用免疫组化SP法分别检测KANK1在OSCC组织及正常口腔黏膜组织中的表达情况时发现，KANK1在OSCC中的表达明显低于正常口腔黏膜组织。这些研究结果表明，KANK1基因在OSCC中存在低表达，且这种低表达与OSCC的发生、发展有关，其可作为OSCC诊断和治疗的潜在靶点。

此外，近年人们正在研究和关注的还有EYA4、PAX9、STK33、GPR150、INSM1和EPHX3等众多基因，由于检测方法及样本来源的不同，这些基因的启动子甲基化频率存在差异。虽然存在诸多差异，但多数研究表明，DAPK1、DKK3、LATS2等基因在OSCC组织中甲基化频率较高[7，11，15]。这些基因甲基化不仅出现在肿瘤阶段，而且在癌前病变中也能检测到，因此，这些OSCC相关基因启动子甲基化参与了OSCC的发生、发展过程，对其研究有利于OSCC的早期检测和治疗。

3 基因启动子甲基化与OSCC的治疗

基因启动子甲基化的潜在可逆性为新型抗癌药物的开发提供了机会，这些药物可以重新激活表观沉默的肿瘤抑制基因。近年来，随着表观遗传学的发展，一些DNMT抑制剂(如5-氮胞嘧啶、地西他滨等)的开发，并成功地用于治疗包括OSCC在内的多种恶性肿瘤[28]。DNMT抑制剂，可有效地逆转基因启动子高甲基化的肿瘤发生过程，如Zebularine(Zeb)便是一种DNMT抑制剂，GAO等[29]用Zeb处理OSCC细胞后，发现OSCC细胞的生长受到了抑制，其表现为细胞生长/增殖减少，G2/M细胞周期中积累的细胞数量减少。此外，AMARAL等[30]用去甲基化药物地西他滨(5-Aza-CdR)处理OSCC细胞后，观察到5-Aza-CdR导致了O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)去甲基化，并上调了3个重要抑癌基因的转录。其他DNMT抑制剂，包括5-Aza-CR、天然化合物如绿茶多酚等也具有类似的抑制作用，可导致基因组低甲基化，并得到了广泛的研究。

至今为止，通过手术切除原发肿瘤，并根据病理结果进行辅助放疗或放、化疗仍然是治疗OSCC的主要方式，但这些治疗方式都可能导致严重的器官功能障碍。目前，OSCC的治疗方式，如手术、放疗、化疗、光动力疗法、免疫疗法等，已经导致了与非特异性细胞死亡相关的主要问题。因此，迫切需要OSCC治疗的新方法。表观遗传抑制剂的开发为治疗OSCC提供了一种新思路，如DNMT抑制剂，可增加放疗的敏感性[31]，以及改善化疗药物的耐药性[32]。虽然开发这类抑制剂用于OSCC治疗的潜力很大，但去甲基化药物单独应用于临床的作用有限，与放疗、化疗或其他抑制剂结合使用是目前去甲基化治疗的最佳方法。

4 展 望

近年来,随着表观遗传学的不断发展,以及对OSCC的研究愈加深入，越来越多的研究者认识到表观遗传改变特别是基因启动子甲基化在OSCC发展过程中的重要作用。上述研究证实，基因启动子甲基化可以调节OSCC抑癌基因的转录，是一种很有前景的OSCC生物标志物。此外，基因启动子甲基化状态作为检测OSCC的新型生物标志物，相较于癌胚抗原等传统标志物显示出了更高的灵敏度和特异度，对OSCC的临床筛查、诊断、治疗及预后具有很大的价值。

目前进行的启动子甲基化的相关研究大多侧重于单个基因位点启动子甲基化在OSCC中的作用，但是OSCC组织中存在多基因多位点的甲基化，因此，发展和采用高通量的基因甲基化检测方法是该领域的研究趋势。众所周知，基因启动子甲基化是可逆的，针对这个特点，5-Aza-CdR等去甲基化药物得以开发并应用，但目前该药物的给药剂量、维持时间和不良反应尚无定论，仍需大量试验加以验证。相信在不久的将来，对这些基因启动子甲基化状态的持续性研究，将被普遍用于指导OSCC的预防和治疗，并为患者提供个性化治疗方案。