循环肿瘤细胞的检测及其在鼻咽癌中的研究进展

曾蕾，杨凯旋

肿瘤细胞由原发灶或转移灶脱落进入外周血液成为循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs），这一概念由澳大利亚医生ASHWORTH［1］在1869年首次提出。CTCs存在于血液循环系统中，可通过血液进行微转移，是具有高活力、高转移潜能的肿瘤细胞，与肿瘤的复发、转移密切相关。近年来，CTCs作为新型生物标志物已成为各类肿瘤研究的热点，在乳腺癌［2］、肺癌［3］、前列腺癌［4］、结直肠癌［5］等肿瘤诊断中得到了较为广泛的应用。目前CTCs在肿瘤的早期诊断、实时个体化用药指导，监测肿瘤复发、阐明肿瘤耐药机制以及改善临床医生对疾病进展和转移的认识方面起着重要作用［6-8］，近年来，许多学者对CTCs在鼻咽癌的诊断与治疗中的作用开展了大量研究。本文针对CTCs的特性、检测方法、鉴定方法以及其在鼻咽癌中的研究进展做一综述，以提高临床医生对CTCs的认识。

1 CTCs的特性

有研究发现，肿瘤的转移扩散在早期发病时可能就已经出现，而不是之前认为的是肿瘤后期的结果［9］，CTCs可在早期随着血液循环到达并重新定殖于原发病灶或远端器官，保持休眠状态，在特定的条件刺激下释放进入外周血液循环，最终发展成一个明显的复发或转移性病灶［10］。由于肿瘤细胞的异常增殖和代谢，其基因表达与修饰、蛋白合成与修饰以及某些极性颗粒物质积聚发生异常，导致肿瘤细胞的大小、形态、介电属性和细胞表面的标志蛋白均与正常细胞不同，是分离肿瘤细胞的理论基础［11］。通常，CTCs与正常外周血细胞比较，具有核质比大、体积大（白细胞直径为8～10 µm，红细胞为 8 µm，CTCs为 12～25 µm）、质量重、密度高等特点。CTCs的细胞表面具有某些特异性的蛋白标志物，是与其他血细胞的区别。上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是肿瘤细胞特有的标志蛋白，在CTCs中特异性高表达，而在血细胞中不表达。此外，部分细胞角蛋白（cytokeratins，CKs），例如：CK6、CK18、CK19，也是其特异性标志物，但是CTCs不表达白细胞的表面标志蛋白CD45。因此，根据以上研究结果将CTCs的免疫组织学概念定义为细胞表面EpCAM（+）/CK（+）/CD45（-）的有核细胞。有研究在健康人体的血液中进行验证，没有发现具有相同免疫组织学特征的非恶性上皮细胞［12］，但在某些良性疾病患者血液中却发现了具有相同免疫特性的细胞，如良性结肠病变［13］、胰腺病变［14］、良性乳腺疾病［15-16］等，表明有必要对CTCs进行进一步的分子表征分析。

在恶性肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤细胞可与周围环境发生作用，从上皮细胞转换为间质细胞，这一过程称为上皮 -间 质 转 换（epithelial-mesenchymal transition，EMT），EMT使肿瘤细胞失去了上皮细胞的一些特性，如细胞间的黏附作用、细胞极性等，获得了间质细胞的一些特性，如运动、侵袭、抵抗凋亡等［17］。EMT使得肿瘤细胞的类型发生了改变，降解基质的能力提高，细胞间的结合力减弱，因此转换后的肿瘤细胞获得了更强的转移及侵袭能力，在血液中也更易存活［18］，且与肿瘤的抗药性存在相关性［19］。通过EMT使CTCs获得了肿瘤干细胞的自我更新、侵袭倾向和耐药特性［20］，这可能是肿瘤转移过程中的关键。EMT使肿瘤细胞脱离原发灶或转移灶进而形成新的继发转移灶，因此EMT被认为是肿瘤细胞扩散至血液循环中的重要过程［21-25］。有新的证据表明，CTCs是高度异质性的，包括上皮细胞表型、上皮与间质细胞混合表型、间质细胞表型以及循环肿瘤干细胞表型CTCs［26］。而由于发生了EMT，间质细胞表型CTCs比其他类型的CTCs具有更强的转移侵袭能力和耐药性。此外，在一项乳腺癌研究中，对CTCs进行基因分析时发现外周血液中的CTCs与原发灶肿瘤细胞相比发生了基因变异，可能是因为CTCs在周围环境影响下发生了自身适应性改变，与肿瘤的耐药性具有一定的相关性，这也说明CTCs具有一定的基因突变能力［27］。CTCs的这些物理学及生物学特性是从外周血分离和富集CTCs的基础。

2 CTCs的检测

CTCs的检测主要分为富集以及鉴定两个部分，CTCs的数量在血液中处于极低水平，每106～107个外周血细胞才可能有1个CTCs，这就要求CTCs检测技术不仅要有较高的灵敏度，以捕获稀少的CTCs，同时也要有较高特异度，以排除外周血中的其余细胞，因此在上亿个外周血细胞中分离富集得到CTCs较为困难，并且这也是CTCs计数及分子特征检测的关键［28］。

2.1 CTCs的富集 根据CTCs的物理学及生物学特性，将CTCs的富集方法分为非特异性富集法及特异性富集法。非特异性富集法是指根据CTCs的密度、大小、表面电荷及可变形等性质对CTCs进行分离富集，其中代表性方法的是膜过滤法和密度梯度离心法。膜过滤法依据CTCs直径普遍大于血细胞直径这一特性，用孔径为8 µm大小的滤过膜分离血细胞从而得到CTCs，富集效果较好［29］。密度梯度离心法根据CTCs与其他外周血细胞密度的差异，通过相应的密度离心递质将CTCs与外周血细胞分离，但这种方法的特异度较低，得到的结果可信度欠佳，在临床上使用较少。特异性富集法指利用特异性抗体与细胞表面抗原进行特异性结合来获取CTCs（阳性分选法），或者去除血细胞而留下CTCs（阴性分选法）。阳性分选法是通过标记CTCs表面抗原直接捕获CTCs，最常用于阳性分选法的抗原为EpCAM，其是CTCs特有的标志抗原，在CTCs中特异性高表达，而在血细胞中不表达。而阴性分选法则通过CTCs不表达的抗原（如CD45）来去除外周血细胞，以达到富集CTCs的目的［30］。下面将介绍几种具体的CTCs分离富集方法。

2.1.1 免疫磁珠分离技术 免疫磁珠分离技术是一种以特异性抗原抗体反应为基础的免疫学分离技术，利用细胞表面的特异性抗原与磁珠上的特异性单克隆抗体相结合，形成抗原-抗体-磁珠复合物，使细胞具有磁性，在磁场中被吸附并滞留于磁场中，相反无该种特异性抗原的细胞则不能与磁珠结合且不具有磁性，不能在磁场中逗留［31］。利用免疫磁珠分离技术分离CTCs，根据磁珠表面特异性抗体的不同分为阳性分选法和阴性分选法。阳性分选法主要利用磁珠表面抗EpCAM抗体与CTCs表面表达的特异性EpCAM相结合，从而捕获到外周血液中的CTCs，目前在临床上使用这种方法的代表是CellSearch系统，是目前唯一被美国食品与药品监督管理局批准用于结直肠癌［5］、前列腺癌［32］和转移性乳腺癌［33］CTCs检测的免疫磁珠分离技术。但是，这种方法的不足在于其对CTCs的捕获依赖于细胞表面EpCAM的表达，比较适用于EpCAM表达较高的肿瘤类型。部分CTCs由于发生了EMT而存在异质性，不同类型CTCs表面的EpCAM表达不同，因此其在CellSearch系统中的检出率可能偏低［34］。阴性分选法则是利用在CTCs中不表达，而外周血细胞中表达的相关抗原（通常是CD45）与磁珠上的特异性抗体结合，从而分离出外周血细胞，富集得到血液中的CTCs。阴性分选法不依赖于CTCs表面抗原的表达，不受EMT的影响，适合富集的CTCs类型相对阳性分选法较广，同时其也可以避免磁珠直接作用于CTCs破坏细胞。但是阴性分选法步骤复杂，在操作过程中可能也会破坏 CTCs［31］。

2.1.2 基于微流体平台的CTCs分离技术（CTCs-芯片）CTCs-芯片是一种具有抗EpCAM抗体涂层的微流体装置，由精细构造的微柱组成，允许分子较小的细胞自由通过，而将分子较大的细胞转移到捕获“陷阱”［35］。CTCs-芯片是近年逐渐发展起来的CTCs分离富集技术，其作用原理是将可结合CTCs的抗体固定在固相表面，当血液中的CTCs流经芯片时即可被抗体特异性识别并选择、富集。CTCs-芯片的优势在于可使用包被在不同固相表面的不同抗体，即联合多种抗体捕获CTCs，并且可以依照分子表型对不同类型的CTCs进行分别捕获，有利于对不同类型的CTCs做进一步研究。目前，CTCs-芯片已在各类肿瘤研究中广泛应用。NAGRATH等［35］发现CTCs-芯片对乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌以及肺癌患者的CTCs检出率较高。SEQUIST等［36］研究发现利用CTCs-芯片富集得到的非小细胞肺癌CTCs，还可用于检测其表皮生长因子的突变情况，以指导临床个体化用药。

2.1.3 体内富集技术 目前研究人员已开发了从体内分离CTCs的新方法，以便检测更大流量的血液，即将结合EpCAM抗体的针形装置自前臂静脉插入并保持30 min，以在体内进行CTCs的分离富集［37］。例如：CellCollector技术，由一种直径0.5 mm的不锈钢丝组成，带有抗EpCAM抗体涂层，类似于静脉导管，需要从静脉插入，在血液循环中捕获CTCs，此方法的优势在于不局限于血液的量，可获取足够的血液以获取CTCs，目前已在肺癌、前列腺癌治疗中应用，其安全性及有效性亦得到了初步验证［38-39］。虽然这种方法值得尝试，但还需要进行更多的临床研究以确定CellCollector技术是否真正优于传统体外检测装置。

2.2 CTCs的鉴定 无论使用哪一种方法对CTCs进行富集，始终不能得到完全纯化的CTCs。因此，必须鉴定所捕获的细胞是否是CTCs。完成这一目标通常的方法是使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对所捕获的细胞进行染色，DAPI可与双链DNA结合，证明捕获的细胞具有细胞核，接着再使用不同标记的CKs抗体和白细胞抗原抗体（例如抗CD45抗体）来对这些具有细胞核的细胞进行分析［40］。富集的CTCs需要进行细胞计数以及分子分型，用于细胞计数的方法主要包括免疫细胞化学技术（如：免疫荧光法及荧光原位杂交法等）和流式细胞术等，用于分子分型的方法主要包括聚合酶链反应（PCR）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术等［41］。也有一些鉴定系统跳过富集步骤，使用简化的方式来识别CTCs，例如：由EPIC Sciences开发的系统，将血液中的成核组分涂抹到带有可黏附细胞的特殊涂层的载玻片上，随后用DAPI和荧光标记的抗CKs抗体和抗CD45抗体染色载玻片，再用荧光扫描仪扫描，得到反映细胞形态学以及CKs和CD45表达情况的计算机图像［42］。另一种以推定方式鉴定CTCs的方法是通过RT-PCR寻找上皮细胞标志物或相关抗原的转录物。有研究报道，在乳腺癌患者中，存在着CK-19 mRNA阳性的CTCs，因此可认为若使用RT-PCR技术检测到了CK-19的mRNA，则可假设存在CTCs［43-45］。这种方法灵敏度高，但是这些转录子的存在也不能百分之百代表存在CTCs，需要对细胞进行进一步的表型分析或基因分型，这一方法很难实现。针对这一问题，研究人员发明了新的技术，即the Adna Test，通过此技术对感兴趣的CTCs基因产物做进一步基因组标志物分析以补充检测的完整性［46］。

3 CTCs在鼻咽癌中的应用

鼻咽癌是一种头颈部恶性肿瘤，是常发于东南亚尤其是华南地区的主要恶性肿瘤之一，其发病与地理分布、环境和遗传因素密切相关，EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）感染、吸烟史、高危饮食习惯等均可能是鼻咽癌的高发因素［47-49］，但具体病因尚未明确。鼻咽癌是一种放射敏感性肿瘤，其治疗主要以放疗和/或化疗为主，随着放疗技术的提高，患者的5年生存率也在不断提高，治疗失败的主要原因是原位复发及远处转移，且疾病发展不易监测［50-51］。但近年来，CTCs的研究为鼻咽癌的诊断、治疗及预后评估提供了新方法。

ZHANG等［52］进行的一项纳入50例鼻咽癌患者的回顾性研究中发现，46例患者被检测出CTCs，阳性率为92.0%，且疾病分期与CTCs检出率无明显相关性。无论是无远处转移的初诊患者（M0），还是复发或发生远处转移的患者，CTCs数量均随着TNM分期［53］增加而不断增加（从Ⅱ期到Ⅳ期）。LI等［54］回顾性分析了38例鼻咽癌低分化鳞状细胞癌患者，其中TNM Ⅰ期2例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例和Ⅳ期16例，分析患者放疗前、放疗后1周及放疗后1个月外周血CTCs计数发现，52.6%的患者外周血中可以检测到CTCs，放疗后1个月CTCs明显减少，结果表明CTCs数量和检出率与TNM分期及其他临床指标无相关性。HE等［55］在一项纳入33例鼻咽癌患者的研究中发现，不同TNM分期患者均可检测出CTCs，但检出率与TNM分期无相关性。伍勇等［56］对63例初治鼻咽癌患者和20例正常对照人群的CTCs表达情况进行分析发现，鼻咽癌患者CTCs阳性率为55.6%，正常人群不表达CTCs，并且发现鼻咽癌患者CTCs阳性与患者M分期（远处转移情况）相关，与T分期（肿瘤原发灶大小）、N分期（淋巴结转移情况）及总分期无关。吴君心等［57］研究发现，鼻咽癌患者外周血中CTCs阳性与患者N分期相关，CTCs阳性患者淋巴结转移更广泛，提示预后不良，可能成为鼻咽癌患者预后评估的一个辅助指标。SI等［58］研究证实基质金属蛋白酶9（MMP-9）存在于CTCs中，并在间质细胞表型CTCs中表达最多。MMP-9是一种锌依赖性内肽酶，在降解环境屏障中发挥重要作用，在体内外均可发挥促进转移的作用［59-60］。除了转移作用，MMP-9还被证明与鼻咽癌EBV感染密切相关［61］。LIU等［62］研究表明，MMP-9与鼻咽癌预后不良相关。

血浆EBV-DNA定量作为一项无创性检测手段，是鼻咽癌诊治的重要辅助手段，许多研究已将其用于鼻咽癌的诊断、危险分层、监测和预后预测，同时CTCs也逐渐被作为一项有前景的鼻咽癌生物标志物来研究，因此，血浆EBV-DNA与CTCs是否具有协同作用，也成为鼻咽癌CTCs研究的一大热点。HE等［55］的研究发现CTCs的存在可能与EBV的激活状态有关，CTCs阳性鼻咽癌患者的EB病毒壳抗原相应IgA抗体（EBV VCA-IgA）水平高于CTCs阴性患者，且CTCs计数与EBV VCA-IgA和EBV-DNA载量相关，表明CTCs与鼻咽癌患者EBV活化呈正相关。伍勇等［56］研究也发现在EBV-DNA阴性鼻咽癌患者中，CTCs阳性率为45.5%，而在EBV-DNA阳性患者中，CTCs阳性率为78.9%，表明CTCs和EBV-DNA密切相关，CTCs联合EBV-DNA水平用于鼻咽癌病情的评价。YOU等［63］在一项纳入270例鼻咽癌患者的研究中发现，CTCs与血浆EBV-DNA水平相比，诊断鼻咽癌远处转移的灵敏度较差，但特异度较好，但两者协同诊断灵敏度及特异度优于单独使用CTCs或EBV-DVA。此外，该研究还发现在基线以及接受一线化疗后这两个时间点，CTCs计数与EBVDNA水平相对良好的患者，其无进展生存期和总生存期相对于有不良改变的患者均明显延长，表明CTCs和血浆EBVDNA水平在一线化疗前后和化疗期间均可作为鼻咽癌远处转移患者的重要预后指标。且与影像学检查结合，CTCs和EB-DNA则可以提供更加完善的预后信息。

4 前景与展望

随着CTCs富集与鉴定技术的不断进步，CTCs的临床价值越来越凸显，在鼻咽癌中的研究进展也在不断更新。但是，要将CTCs检测广泛应用于鼻咽癌临床实践中，这条路还任重道远。首先，大量研究中CTCs检测技术的原理和方法不同，且各研究方法缺乏统一的标准，从而导致判断标准及检测结果存在较大差异，缺乏可比性，CTCs检测技术有待进一步规范化和标准化；其次，在鼻咽癌患者中常规进行CTCs检测并不常见，到目前为止发表的研究结果都是在小样本群体进行研究的，CTCs在鼻咽癌中的研究结果缺乏前瞻性多中心大样本研究。不同个体CTCs分子表型存在差异，且同一个体CTCs也具有异质性，也是未来研究的重点、难点。期待在不久的将来CTCs检测可为广大鼻咽癌及各类肿瘤患者带来更大的益处。

本文文献检索策略：

以“循环肿瘤细胞、特性、检测方法、鼻咽癌”为关键词检索中国知网、维普网、万方数据知识服务平台， 以“circulating tumor cells、characteristics、detection、nasopharyngeal carcinoma” 为关键词检索 PubMed、Web of Science。检索日期截至2019年9月，共检索到200余篇文献。文献纳入标准为描述循环肿瘤细胞特性、检测方法及其在鼻咽癌中应用的文献，排除循环肿瘤细胞单纯应用于其他肿瘤治疗的相关文献，最终纳入63篇文献。

作者贡献：曾蕾进行文章的构思与设计，文献/资料收集与整理，论文的撰写与修订；杨凯旋进行文章的可行性分析，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。