SPOCK2基因多态性与支气管肺发育不良的关系研究进展*

刘丽巧，肖莎莎 综述，米弘瑛 审校

(昆明理工大学附属医院/云南省第一人民医院儿科 650032)

随着围生医学及NICU技术的不断发展,极低出生体重儿和超低出生体重儿的存活率明显提高,支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的发病率也逐年上升[1-2]，由于出生胎龄小，肺发育极度不成熟,呼吸系统后遗症已成为早产儿长期患病和死亡的重要原因之一[3]。BPD发病机制复杂，目前仍不明确。多项研究结果显示BPD为一种多因素疾病，是遗传因素与环境因素相互作用的结果[4]，即在遗传易感性的基础上各种不利因素如氧中毒、气压伤、容量伤、炎症等导致的肺损伤，以及损伤后肺组织的异常修复，其中炎性损伤与损伤后修复均受基因易感性调控[5]。临床研究发现，在胎龄、出生体重和治疗措施相同的情况下，并非所有的早产儿均发生BPD，其预后也不尽相同。1项对双胞胎的研究发现，同卵双胞胎BPD患病率明显高于异卵双胞胎，不同种族新生儿BPD患病情况也有明显的差异性。这些均提示BPD的发生与遗传因素密切相关。回顾以往的研究，总结遗传相关疾病的研究方法有：家系研究、双胎研究、全基因组关联分析及候选基因研究等，其中候选基因研究具有明显假设驱动优势，即候选基因的选择来源于细胞和动物实验、早期人体研究或相关生物学基础理论，这些研究中基因改变可引起蛋白结构甚至功能改变。近年来一些相关基因的多态性在BPD发生发展过程中的作用日益受到重视。BPD已被证实与相关基因的多态性、表达异常有关，如血管表皮生长因子(VEGF)，肺泡表面活性物质相关蛋白(SPs)、转化生长因子-β1(TGF-β1)及表面活性蛋白D(SFTPD)基因[6-9]，但多数相关的候选基因与BPD的关系需进一步明确。其中睾素2(SPOCK2)基因特别受关注，但其与BPD发生的关系尚不完全清楚，因此本文就SPOCK2基因多态性与早产儿BPD的相关性研究进展予以综述。

1 关于SPOCK2

SPOCK2,又称Testican-2,属于基质细胞蛋白家族(secreted protein，acidic，cysteine-rich，SPARC)成员之一。SPARC的作用是在细胞增殖、周期进程、凋亡、黏附和细胞-基质相互作用等生物学过程中发挥作用。目前已知的同源物为SPOCK-1,SPOCK-2和SPOCK-3；SPOCK2最初被描述为精液中的一种未命名的软骨素/乙酰硫酸蛋白多糖，后来在筛选人cDNA文库中发现,它与中枢神经系统有关，目前在人类的卵巢、睾丸、肺、前列腺和肾脏[10-11]均发现该基因的表达。研究发现人类的乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和子宫内膜癌与SPOCK2的甲基化密切相关[12-13]。

2 SPOCK2的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与BPD

HADCHOUEL等[14]首先观察到SPOCK2基因在大鼠肺部的高表达，并发现SPOCK2是BPD发生的一个风险基因，SPOCK2基因上的SNP rs1049269的关联仅见于白种人(P=0.025,OR=1.79)，而rs1245560的关联在白种人(P=0.02,OR=1.85)及非洲人(P=0.007，OR=2.43) 中均可见，并且这种关联在轻度BPD患儿中并未显示，只在中-重度 BDP患儿中发现，基于轻度BPD不受遗传影响，而中-重度明显受遗传因素的影响，为了系统性研究遗传对极低出生体重儿罹患中、重度 BPD的影响，WANG等[15]使用了一种基于大群体的方法，采用全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)和基于外显子组的基因型鉴定平台，评估了数以百万计的SNP，结果既没有在全基因组显著性水平上鉴定出与中-重度BPD相关的SNP，也没有重复出既往的发现。对于既往研究中发现的与BPD有关的27个SNPs，如表面活性蛋白 D (SFTPD)、白细胞介素-18(IL-18)、超氧化物歧化酶3(SOD3)、基质金属蛋白酶-16(MMP-16)及选择素L(SELL)等均P<0.1,无统计学意义。研究认为最有可能与BPD相关的SNP是rs118078182，这是一种在发育中的肺间质中表达的跨膜胶原，但是由于复制样本量是有限的，真实的信号可能没有被检测到。与此同时，其他学者认为，以P值小于5×10-8的标准对于全基因组来说太过严格，导致检测结果均无统计学意义。同样，MAHLMAN等[16]在BPD 的GWAS中发现，没有一个SNP达到严格的全基因组显著性水平，但存在许多提示性关联，研究中发现中-重度BPD与SNP rs11265269之间存在明显暗示性关联，并且这种联系在芬兰人口和法国的非洲裔婴儿中得到了复制。尽管最初的GWAS信号无一个得到一致的复制，但其中一些可能代表了真正的关联信号。例如，在GWAS中提示与BPD相关的SNP中，RASGFR1(编码Ras蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子1)内的SNP可能代表真正的关联，因为位于该基因附近的其他SNP在BPD的先前GWAS中显示关联信号。此外，其他一些具有提示性相关SNP的基因可能在生物学上与BPD表型相关。例如，已知SGCD基因(编码肌聚糖)与气道反应性相关，这一过程与COPD患者的肺功能下降有关，这些都需要更大规模的研究来评估这些基因在BPD中的潜在作用。

WANG等[15]在进行基因分型时发现：主成分分析的前3个组成部分确定了4个种族群体，分别代表非洲裔美国人，西班牙裔美国人，白种人和亚洲人,并且在每个种族亚群中确定的SNP没有重叠，比如在白种人群中发现的关联性最强的SNP rs6988306在其他种族中均无重复；MAHLMAN等[16]研究中强关联的rs11265269也仅在芬兰人口和法国的非洲裔婴儿中得到了复制。尽管既往研究种族混合群体中已显示出BPD对成人和儿童肺功能的影响，并且最新的研究也显示BPD具有明显种族差异性[17]，但在不同人种中的BPD与SPOCK2的基因相关性还需进一步证实。

3 SPOCK2在BPD中可能的作用机制

3.1 SPOCK2与MMPs

HADCHOUEL等[14]观察到SPOCK2基因在大鼠肺部高表达，而且在肺的发育过程中SPOCK2 mRNA水平变化显著。一般来说，肺泡化通常发生在大鼠的第4～21天，他们发现SPOCK2基因的表达在肺发育过程的微观和囊泡阶段表达水平非常低，而在肺泡化时开始显著升高，在第18天时表达水平达到峰值，一直持续至第28天,随后降低至正常新生鼠的水平，这提示肺发育和终止过程与SPOCK2密切相关。HADCHOUEL等还发现SPOCK2是由肺成纤维细胞和上皮细胞合成的，然后沉积在包括基膜在内的细胞外基质(ECM)中，免疫荧光研究显示SPOCK2在整个ECM中均表达。

有研究表明SPOCK2与基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-14、MMP-16相互作用，在肺发育中起关键作用并与BPD风险有关[18-20]，并且于正在发育的肺中，MMP-2在次级分离过程中充当主要的蛋白酶。SPOCK1和SPOCK3可抑制MMP-14和MMP-16，并将pro-MMP-2水解成其活性形式，而SPOCK2则通过其NH2末端独特结构域与SPOCK3的COOH末端结构域结合，消除这种抑制作用，从而使得MMP-2被激活，最终促进ECM的降解和细胞的迁移和侵袭[18]。为进一步研究SPOCK2在肺发育过程中的作用是否由MMP-2激活介导，HADCHOUEL等[21]设计了SPOCK2抗体在高氧条件下和在空气中对MMP-2的激活作用，结果显示与之前的报道一致[22]：在空气暴露的大鼠中MMP-2活性显著减少，而高氧条件下MMP-2的活性被激活，但在高氧条件下，注射生理盐水的动物和注射抗体的动物之间MMP-2的激活率无显著差异，基于此，他们认为SPOCK2在肺泡发育中的作用可能与MMP-2激活有关，但由于缺乏相关模型印证，该假设并未被确认。

3.2 SPOCK2与肺泡上皮细胞转化

为进一步研究SPOCK2在肺发育过程中的作用，HADCHOUEL等[21]设计了两种小鼠模型，一种使用特定的SPOCK2抗体，一种通过转基因小鼠模型重现高氧诱导的SPOCK2表达，从而导致条件性和肺靶向SPOCK2的表达。在高氧条件下饲养小鼠时，用SPOCK2抗体治疗可显著改善肺泡形成。SPOCK2的过度表达改变了在室内空气中繁殖的幼鼠的肺泡发育，并加剧了高氧血症引起的病变。这项研究为SPOCK2对肺泡发育的有害作用提出了有力的论据，尤其是在肺损伤后，提示其在BPD敏感性中的作用,这些作用不是通过金属蛋白酶活性的释放和正常肺泡形成所必需的因子的表达来介导的,可能涉及Ⅰ型(AT1)和Ⅱ型上皮肺泡细胞(AT2)之间的平衡。

有研究证实了AT2在发育过程及肺损伤后充当AT1的祖细胞[23]，而SPOCK2是AT2向AT1转化的早期标志[24]。研究发现当AT2细胞在胶原上培养时，SPOCK2促进其快速向AT1的转分化，而当AT2细胞在基质凝胶上培养时，SPOCK2的表达水平并无改变[24]。通过对转基因小鼠和对照小鼠的肺进行形态分析，HADCHOUEL等[21]证明了SPOCK2在肺泡发育中的有害作用，这在肺损伤后表现尤为明显，同时也提示其在BPD易感性中的作用，这种效果可能是由AT2和AT1细胞之间的失衡介导，但是由于缺乏足够的AT2细胞来进行细胞增殖和修复，这是二次分裂和最终肺泡形成所必需的。这个假设需要进一步的研究来证实。

3.3 血液中的微RNA(miRNAs)可成为新生儿BPD的标志物

研究发现rs1049269这个SNP位点位于SPOCK2基因的3′UTR区域，根据理论推测可能会影响miRNA的结合，调控SPOCK2基因的后转录水平，进而对BPD的发生发展产生影响。miRNAs属于内源性非编码RNA,长约20～22个核苷酸。miRNAs不编码蛋白，但在基因表达中发挥十分重要作用，主要显示在转录和转录后水平调控基因的表达。大部分miRNAs位于内含子区，少数位于外显子区。miRNAs先在核内由RNA 聚合酶Ⅱ转录成初miRNAs(primary miRNAs，pri-miRNAs)，pri-miRNAs在Drosha-DGCR8复合物的作用下形成带有发夹结构的前体miRNAs(precursor miRNAs，pre-miRNAs)，再与转运蛋白5(exportin-5)结合转运至细胞质，并由Dicer酶剪切形成双链的miRNA(miRNA-3p和miRNA-5p),这是来自于pre-miRNAs的互补的两条链。在与靶位点结合时，其中任意一条链均可作为成熟miRNAs，miRNAs 与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex RISC)整合，通过其5′端第2～8位碱基与靶基因mRNA 3′UTR 结合，进而抑制靶基因的翻译或使其降解，从而抑制基因的表达。在新生儿BPD中，WU等[25]在15例对照组和15例BPD患儿中，对365个miRNAs进行了筛查，结果发现4个miRNAs (miR-152,miR-30a-3p,miR-133b,和miR-7) 出现了异常的表达。临床上也多次报道了肺发育过程中miRNA的动态调节和接触调节。 HU等[26]发现miR-29a的下调可以共同提高GAB1的表达，减少细胞凋亡并刺激增殖，最终阻碍BPD的发展。SHAH等[27]发现miR-184-3p的过表达加剧了BPD肺表型，而下调miR-184-3p的表达改善了BPD的表型并改善了呼吸功能。上述研究均提示血液中的miRNAs成为新生儿BPD的标志物是可行的。米弘瑛等[28]通过荧光定量PCR技术分析SPOCK2的表达水平，和可能与该基因在rs1049269位点相结合的3个miRNAs(miR-194，miR-939和miR-449b)的表达水平，探明SPOCK2基因及与该基因3′UTR结合的miRNAs在中国人群的表达水平变化，分析SNP对miRNAs与SPOCK2基因结合性的影响，结果显示SOPCK2基因多态性位点rs1049269 AG基因型和G等位基因频率与BPD有关，是BPD发病的高危因素，但是由于该研究纳入的病例较少，因此尚未进行rs1049269与不同程度BPD的相关性分析。此外，由于rs1049269位于SPOCK2基因的3′UTR区域，推测该位点可能通过影响某些miRNAs同SPOCK2的结合进而影响SPOCK2的表达，但这仍需进行更深入及更大样本量的研究验证。

4 展 望

综上所述，SPOCK2与BPD的相关性目前仍未明确。全基因组关联研究也并未发现特定的SNP位点[16-17]，这提示BPD可能不是由单个基因介导，而是多基因介导的疾病,未来需要更大样本的研究和更深入的动物试验加以验证。至今为止，基于BPD的分子遗传学研究结果间的一致性也较低，尚无公认的研究结论[30]。作为一个多系统共同参与、病理生理复杂的疾病，BPD对患儿的影响可持续至整个婴儿期甚至成年早期，最新的研究揭示：BPD早产儿发展为慢性阻塞性肺疾病(COPD)的风险较大，这是一种威胁人类生命的肺部疾病，几乎无有效的治疗方法[31]。因此，研究BPD的发病机制具有重大临床意义，相信随着未来医学的不断进步与发展，SPOCK2基因多态性与BPD的关系研究会越来越深入，越来越明确，为BPD的发病机制、治疗提供新的思路和方向。