m6A甲基化修饰在食管癌中的研究进展

朱凌妍，沈艺，邵毅，刘芬

食管癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一，据2018年全球癌症统计数据显示，食管癌是全球第七大最常见的癌症，是第六大癌症死亡原因［1］。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC） 和 食 管 腺 癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）是食管癌最主要的病理类型，其中，ESCC约占全部食管癌患者的90%以上［2］。我国是世界上食管癌高发国家之一，研究表明尽管食管癌的5年生存率从20.9%提高到30.3%，但在过去10年中，食管癌仍是影响健康、导致寿命损失的主要原因［3-4］。食管癌的人群发病危险因素与年龄、性别、职业、种族、地域、生活环境、饮食生活习惯、遗传易感性等有一定关系；并且食管癌的发生和进展是一个多阶段、多因素的过程，涉及基因组、转录组和表观转录组之间复杂的相互作用［5］。因此，深入研究食管癌发生、发展的诱发因素及潜在机制，发现诊断和预后的生物标志物成为迫切需要。

近年来相关研究发现，6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）作为真核细胞中最丰富的表观转录组修饰，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用［6］。研究表明，在数百种已知的RNA修饰中，m6A甲基化修饰是信使RNA（messenger RNA，mRNA）中最常见的内部修饰，影响RNA的剪切、翻译、稳定性以及某些非编码RNA的表观遗传效应。在哺乳动物细胞中平均每1 000个核苷酸中有1～2个m6A甲基化位点［7］。m6A甲基化调节因子已被证实在多种肿瘤中异常表达，在细胞增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为的调控中发挥了重要作用［8］，并参与白血病、胶质母细胞瘤、肺癌、肝癌等多种癌症的发生、发展过程［9］。本文总结了有关m6A甲基化修饰与食管癌的研究成果，并阐述了m6A甲基化修饰调节因子的组成、作用方式、在食管癌疾病进展中的生物学功能以及m6A甲基化修饰在食管癌中的预后价值、潜在的临床应用等方面的研究进展，为深入探索食管癌发生发展机制、寻找食管癌生物标志物和治疗靶点提供理论基础。

1 m6A甲基化修饰的生物学功能

m6A甲基化修饰是一种动态可逆的修饰过程，主要受m6A甲基转移酶复合物（writers）、m6A去甲基化酶（erasers）、m6A识别蛋白（readers）共同调控［10］。

1.1 m6A甲基转移酶 m6A甲基转移酶复合物主要由甲基转移酶样3（methyltransferase like 3，METTL3）和甲基转移酶样4（methyltransferase like 4，METTL14）及其辅助因子肾母细胞瘤1相关蛋白（wilms tumor 1 associated protein，WTAP）组成。METTL3是重要的催化酶，与METTL14以1∶1的比例形成二聚体复合物，METTL14则起到稳定METTL3并识别RNA底物的作用，WTAP与METTL3和METTL14相互作用，帮助其定位在核斑点区［11-13］。m6A甲基转移酶还包括病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白（Virilizer like m6A methyltransferase associated protein，VIRMA/KIAA1429）、RNA 结合基序蛋白15（RNA binding motif protein 15，RBM15）、 锌 指 CCCH 结构域蛋白13（zinc finger CCCH domain-containing protein 13，Zc3h13）、Casitas B系淋巴瘤原癌基因转化序列样蛋白1（Casitas B-lineage lymphoma-transforming sequence-like protein 1，CBLL1/HAKAI）等［14］。这些m6A甲基转移酶则通过细胞间信号相互作用与m6A复合体结合，招募m6A复合体到达特定的RNA位点。METTL16是METTL3的同源物，是一种新发现的m6A甲基转移酶，其作用是控制细胞SAM水平并将U6小核RNA甲基化［15］。

1.2 m6A去甲基化酶 目前，肥胖相关基因（fat mass and obesity associated，FTO）和AlkB同源物5（AlkB homolog 5，ALKBH5）是主要的m6A去甲基化酶。2011年JIA等［16］首次发现FTO在体内诱导RNA m6A去甲基化，证明了m6A修饰的动态可逆。FTO与核小斑部分共定位，敲低FTO能引起m6A修饰增加，过表达则导致修饰减少；既往研究发现m6A去甲基化酶FTO在乳腺癌、肺癌、白血病、宫颈鳞癌等恶性肿瘤中发挥重要作用［17-18］。ALKBH5与FTO同源，有助于保持m6A修饰在转录组中的平衡，并且m6A是目前已知的唯一底物。但是ALKBH5和FTO的表达模式不同，两者对m6A修饰的去甲基化作用是相互独立的［19］。ALKBH5可促进多种实体肿瘤的发展，并促进相关肿瘤干细胞的自我更新［20］。在最近的研究中发现了另一种m6A去甲基化酶ALKBH3，但相比于mRNA或核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA），ALKBH3更优先作用于转运RNA（Transfer RNA，tRNA）中的m6A［21］。

1.3 m6A识别蛋白 m6A识别蛋白包括含YTH结构域的 YTH结 构 域 蛋 白1-2（YTH domain-containing 1-2，YTHDC1-2）、YTH N6甲基腺苷、RNA 结合蛋白1-3（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1-3，YTHDF1-3），以及不含YTH结构域的胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白1-3（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 1-3，IGF2BP1-3 ）、异质核糖核家族蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP）成员等［22-23］，识别蛋白通过识别m6A甲基化修饰发挥生物学功能，产生下游效应。YTH结构域家族具有保守的m6A结合结构域，优先与m6A修饰的RNA在RRm6ACH共识序列上结合［24］。HNRNPA2B1通过结合m6A甲基化转录促进微小RNA（microRNA，miRNA）的加工和成熟［25］。与YTHDF2促进mRNA衰变的功能相反，IGF2BPs以m6A依赖的方式促进靶mRNA的稳定性，从而影响基因调控［26］。除了调节RNA的稳定性外，结合蛋白YTHDF1、YTHDF3、IGF2BP1/2/3、YTHDC2与m6A结合同样促进了靶mRNA的翻译［27］。

2 m6A甲基化修饰与食管癌

m6A甲基化是RNA中一种丰富的修饰物，参与RNA表达、剪接、核输出、翻译、衰变等过程，并且影响RNA与蛋白质的相互作用。m6A修饰的mRNA介导细胞增殖、迁移和侵袭等功能和肿瘤进展，与肿瘤的发生和转移密切相关［28］。m6A甲基化修饰相关蛋白异常表达，能够导致食管癌的恶性增殖、迁移、侵袭等。在一项关于m6A修饰基因遗传变异与中国人群ESCC发生的研究中，作者发现了一个与ESCC易感性显著相关的单核苷酸多态性，即YTHDC2启动子rs2416282；并在体外实验中证明了，rs2416282调控YTHDC2的表达，而敲除YTHDC2则促进ESCC细胞增殖，结果显示rs2416282通过调节YTHDC2的表达来影响ESCC发生的风险［29］。因此，研究m6A甲基化修饰在食管癌中的生物学功能，鉴定m6A修饰的关键因子改变对阐明食管癌发病机制具有重要意义，可以为食管癌的临床治疗提供理论基础。

2.1 m6A甲基化酶与食管癌 有研究认为，METTL3的过表达会促进人类食管癌细胞系Eca-109和KY-SE150细胞的增殖、克隆、迁移和侵袭［30］，并抑制细胞凋亡；双效抑制剂（BEZ235）通过抑制AKT和mTOR的磷酸化阻止了过表达的METTL3对Eca-109和KY-SE150细胞增殖和迁移的影响，进而证明METTL3通过AKT信号通路在人类食管癌发病过程中发挥致癌作用。HU等［31］研究发现，METTL3在ESCC组织和细胞系中呈高表达状态，且METTL3的上调与食管癌TNM晚期、转移和较差的预后有关；而抑制METTL3则可通过下调PI3K/AKT信号通路抑制ESCC细胞的恶性表型，提示METTL3表达上调可能参与到ESCC的恶性进展过程中，可作为ESCC患者预后恶化的预测因子。

2.2 m6A去甲基化酶与食管癌 FTO是m6A甲基化修饰的去甲基化酶，已被报道参与了多种肿瘤的发生，包括胃癌、急性髓细胞白血病和宫颈鳞状细胞癌等。有研究发现，ESCC组织中FTO的表达高于邻近正常组织，FTO高表达的ESCC患者预后较差；功能实验结果显示，沉默FTO抑制了ESCC细胞的生长和迁移；FTO对裸鼠ESCC细胞发挥了致癌作用；同时，发现MMP13在mRNA和蛋白水平上均受到FTO的正向调控，提示FTO在ESCC中表达上调并起到致癌作用，MMP13可能作为FTO的下游靶点发挥生物学作用［18］。有研究认为，ALKBH5通过调节细胞周期进程促进ESCC细胞增殖，对177例ESCC患者的肿瘤组织芯片进行分析发现，ALKBH5呈高表达状态，且与较低的5年总生存率相关，可认为ALKBH5是ESCC患者预后不良的因子，可能是ESCC患者的一个新的治疗靶点［5］。另一项研究发现，miR-193-3p-ALKBH5反馈环路在体外实验中促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭，在体内实验促进肿瘤的生长和迁移，由此证明miR-193a-3p与ALKBH5之间在ESCC中存在一种新的正反馈调控作用，有助于了解ESCC的发病机制，为ESCC提供新的治疗靶点［32］。

2.3 m6A识别蛋白酶与食管癌 有研究发现，在ESCC中高表达的长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）（LBX2-AS1）被ZEB1激活后，通过与m6A识别蛋白酶HNRNPC的相互作用增强ZEB1和ZEB2的mRNAs稳定性，从而促进ESCC细胞的迁移和上皮间质转化［33］，证明了lncRNA通过与RNA识别蛋白相互作用调节靶mRNA的稳定性，从而在食管癌的发生发展过程中发挥作用。GUO等［34］利用TCGA数据库中食管癌样本数据，采用Lasso Cox回归模型构建ALKBH5和HNRNPA2B1的食管癌预后模型，分析发现HNRNPA2B1的表达与食管癌的肿瘤直径和淋巴转移呈正相关，并且在食管癌高危亚型中表达较高；敲除HNRNPA2B1可抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，过表达HNRNPA2B1促进了细胞凋亡，并通过上调新脂肪酸合成酶ACLY和ACC1促进食管癌的发展，提示HNRNPA2B1可能是食管癌预后生物标志物和治疗靶点。IGF2BP1是一种转录后调节因子，其功能是作为一种致癌基因来促进细胞增殖和侵袭，IGF2BP1受到多种miRNAs的调控，从而影响肿瘤的发生和发展［35］。研究发现，miR-454-3p过表达在蛋白质和mRNA表达水平上抑制IGF2BP1的表达，且通过ERK和AKT信号通路靶向作用IGF2BP1进而抑制食管癌细胞增殖、迁移和凋亡，这些结果表明miR-454-3p通过靶向结合IGF2BP1在食管癌中发挥重要的抑癌作用［36］。在一项探讨IGF2BP2 rs1470579 A＞C多态性与食管胃交界部腺癌风险关系的研究中发现，IGF2BP2基因rs1470579 CC基因型可能是食管胃交界部腺癌发生的保护因素［37］。ELAVL1可以通过结合一些不稳定mRNA的3'UTR上的ARE元件来提高其靶mRNA的稳定性，有研究发现细胞质ELAVL1表达水平与淋巴结转移、肿瘤浸润深度、临床分期呈正相关［38］。LI等［39］首次利用小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）片段提供了ELAVL1与磷脂重构的连接机制，证明ELAVL1参与了LPCAT2的过表达，从而进一步催化了食管癌细胞中LPC（16∶0）向PC（16∶0/18∶1）的转化，确定了LPC（16∶0）和PC（16∶0/18∶1）两个因素参与到食管癌的发展进程，这可作为临床预后指标，以预测患者对辅助治疗或晚期疾病免疫治疗的反应。

2.4 m6A甲基化修饰与食管癌预后 目前尽管关于治疗食管癌的外科技术和化疗方案有所进步，但ESCC患者的生存率并没有显著提高，ESCC患者预后不佳的主要原因是大多数患者起病隐匿，确诊时已经进展至中晚期并伴有淋巴转移，缺乏成功的治疗策略。因此，研究食管癌的分子发病机制对识别有效的预后生物标志物和治疗靶点十分必要。

既往研究表明，m6A甲基化修饰调控因子在多种恶性肿瘤的发展过程中发挥着启动子或抑制子的作用［40］。XU等［41］使用TCGA数据库分析13个m6A甲基化调控因子在食管癌中的表达情况，发现多数m6A甲基化调控因子表达异常，并与食管癌患者的临床病理特征和总体生存率显著相关；构建由HNRNPC和ALKBH5组成的预后危险评分，具有较好的预后价值。后续实验结果显示：在食管癌组织中，低表达的ALKBH5与较差预后相关，高表达的HNRNPC则与食管癌患者的总体生存率呈负相关。XIA等［42］通过分析GEO数据集发现，与癌旁组织相比，ESCC组织中METTL3的表达水平上调，免疫组化结果显示METTL3同样呈高表达状态；在TNMⅠ～Ⅱ期亚组和TNM Ⅲ期亚组中，METTL3表达水平越高预后越差，并且METTL3的高表达与TNM分期及不良预后相关，可认为METTL3的表达上调是影响ESCC的独立预后因素。研究发现，IGF2BP3在ESCC细胞中发挥放射性脱敏剂的作用，通过siRNA抑制IGF2BP3的表达后，ESCC细胞的辐射敏感度显著增强，基于此结论WAKITA等［43］发现，IGF2BP3的高表达状态与食管切除术后未辅助化疗的患者预后不良有关，并可以作为评估是否需要术后辅助化疗的标志。

2.5 m6A甲基化修饰与食管癌术后治疗 术后辅助化疗已成为治疗晚期食管癌的一种有前途的治疗策略，但是相关研究报道显示晚期食管癌患者对顺铂类化疗的反应率仅为中等。因此，对于加强常规化疗，提高治疗前对化疗反应的预测能力，寻找ESCC治疗的靶向基因具有重要意义。有研究发现，eIF4E在ESCC组织中表达明显升高，并显著促进了EC9706细胞的增殖、存活、转移和侵袭；体外和体内实验结果均显示，eIF4E过表达与顺铂治疗的化疗耐药性密切相关，而敲低eIF4E则显著增强了顺铂诱导的细胞毒性，增强癌细胞对顺铂治疗的体内外敏感性，提示eIF4E与传统抗癌药物的联合应用将成为肿瘤靶向治疗的新策略，有望成为ESCC常规化疗的替代方案［44］。LIU等［45］对57例术前行PET/CT扫描的食管癌患者的癌症组织进行免疫组化染色发现，METTL3、GLUT1和HK2呈高表达状态，GLUT1、HK2、SUVmax和18F-FDG的摄取均与METTL3表达呈正相关，且METTL3可通过调节GLUT1和HK2增加18F-FDG的摄取，进而认为PET/CT可能是预测食管癌患者METTL3表达的无创监测工具，有助于临床治疗。

3 总结与展望

综上所述，m6A甲基化修饰在食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程中具有重要的调控作用，并在预测食管癌预后和靶向治疗方面具有较大的研究价值和临床意义。但是m6A甲基化修饰与食管癌的关系仍需深入探索。首先，需进一步明确m6A甲基化修饰调节因子在食管癌发病机制中的生物学功能；第二，m6A甲基化修饰调节因子作为食管癌潜在的诊断或预后标志物有待进一步研究；第三，尽管目前有研究认为m6A甲基化修饰调节因子及其相关通路可以作为食管癌的治疗靶点，但是仍需开展更多生物学实验及临床研究探索其作为治疗靶标的特异性。因此，期待更多的研究关注m6A甲基化修饰在食管癌中的作用，探讨m6A甲基化修饰调节因子是否可以作为食管癌治疗的新靶点，提高食管癌患者的生存率，并为食管癌的精准治疗奠定基础。

作者贡献：朱凌妍、刘芬进行文章的构思与设计；刘芬进行研究的实施与可行性分析；朱凌妍、沈艺、邵毅进行资料收集；朱凌妍进行资料整理、撰写论文；朱凌妍、沈艺、邵毅进行论文的修订；刘芬负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

本文文献检索策略：

检索PubMed和Web of Science等数据库，关键词为“RNA methylation” “N6-methyladenosine”“m6A”“cancer”“tumor”和“carcinoma”，检索时间为建库至2020年12月。并收集2020年12月前国内外公开发表的所有RNA甲基化的m6A修饰的相关研究。此外手动检索文献中的参考文献及新近发表的综述性文章。