母乳中可溶性TLR2对HIV感染的作用①

刘洪杉 何秋水 （首都医科大学基础医学院病原生物学系，北京100069）

Toll 样受体（Toll like receptors，TLRs）属于Ⅰ型跨膜受体，由胞外域、跨膜域和胞内域三部分组成。TLRs 参与识别病原体相关模式分子（pathogen-asso⁃ciated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）后触发信号级联反应，激活NF-κB 信号转导通路，促进下游抗病毒和促炎症细胞因子产生［1-2］。NF-κB激活后通过结合反转录病毒基因长末端重复序列（long terminal repeated，LTR）以促进病毒复制［3］。人类TLR2 位于4 号染色体，定位于细胞膜表面，可与TLR1、TLR6 和 TLR10 形成异源二聚体［4］。目前有许多病毒蛋白已被鉴定为TLR2 的新型PAMPs，包括DNA 病毒、单正链RNA 病毒、单负链病毒、双正链病毒［5-12］。

1 TLR2在HIV感染中的作用

HIV病毒属于慢病毒属，是一种强变异性病毒，可大量破坏以CD4+T 细胞为代表的宿主免疫细胞，影响人体免疫系统对病毒的抵御能力［13］。HIV-1 结构蛋白 p17、p24 和 gp41 可引起 TLR2 介导的细胞活化并增加前病毒DNA 含量，进而加重T 细胞中的HIV 感染和 HIV-1 病毒在巨噬细胞中的复制［12，14-15］。此外，HIV-1 gp120 可增加TLR2 引起的病毒复制和TNF-α、IFN-β 分泌［16-18］。TLR2/TLR1 异源二聚体可识别 HIV 结构蛋白 p17 和 gp41，TLR2/TLR6 可识别HIV p24 结构蛋白并引起免疫激活。此外，在没有TLR6 的情况下，单独 TLR2 与 HIV p24 结合后可阻断p17和gp41所引起的免疫激活［12］。尽管目前关于TLR2 与 TLR10 的研究较少，但也提出 TLR2 可与TLR10 形成自源性或异源二聚体共同识别gp41，影响HIV在机体内引起的免疫反应［19］。

2 母乳中sTLR2与HIV作用机制

可溶性 Toll 样受体（soluble toll like receptors，sTLRs）与 TLRs 胞外域高度同源，可与 TLRs 竞争结合配体，是TLRs的负反馈调节途径之一［20］。细胞膜表面的TLR2 结构域脱落后，整联蛋白金属蛋白酶（a distintegrin and metalloproteinase，ADAM），包括ADAM10 和ADAM17，对脱落蛋白进行水解切割后生成可溶性Toll 样受体2（soluble toll like receptor 2，sTLR2）［21］。母乳中的 sTLR2 可与 sCD14 结合形成异源二聚体，受到经典配体Pam3Cys刺激，影响二者的结合，以此实现sTLR2的激活［21-22］。sTLR2可能通过与sCD14 相互作用和/或与细胞膜结合的CD14发挥其抑制活性，从而干扰脂肽对CD14 介导的细胞膜 TLR2 的触发及信号传导［21，23］。sTLR2 存在于多种体液之中，首先发现以高浓度形式存在于母乳中［24］。母乳中 sTLR2 作为诱饵受体结合多种PAMPs 和DAMPs 来干扰细胞膜表面TLR2 的激活，减少病毒感染后靶细胞的募集，帮助调节细胞的过度活化［25］。

现有研究发现，母乳可以保护发育中的婴儿免受环境病原体侵害，无论母体HIV 感染状况如何，母乳喂养均可降低婴儿出生6个月内HIV 母婴传播（MTCT）的风险［26-27］。尽管对母乳是如何保护婴儿不被感染HIV 的具体原理仍在研究，但可以肯定的是，母乳中具有抗病毒活性的免疫成分［28-29］。对HIV 患者母乳组成成分进行分析发现存在大量sTLRs［24］，将尼日利亚的 HIV 感染患者母乳与尼日利亚和加拿大的未感染患者母乳中sTLR2的表达水平进行对比发现，感染患者sTLR 平均浓度水平在104~105pg/ml，未感染患者sTLR 平均浓度水平在103~104pg/ml，HIV 感染患者母乳中 sTLR2 浓度水平明显升高［30］。鉴于 TLR2 在 HIV 感染中的重要作用，由此推断sTLR2 亦是抑制HIV-1 蛋白诱导细胞活化的重要免疫因子。

sTLR2 通过与HIV-1 结构蛋白的直接相互作用而干扰病毒在宿主细胞上的附着，对HIV-1 感染有显著抑制特性，并抑制了病毒诱导的NF-κB 信号通路的活化和炎症反应，且随着体内sTLR2 浓度的增加，对HIV的抑制作用越强，可一定程度上减缓HIV疾病进程［12，31］。母乳中 HIV-1 蛋白 p17、p24 和 gp41或Pam3CSK4的增多均可使乳腺上皮细胞和单核巨噬细胞分泌产生的 sTLR2 增多［30］。sTLR2 可与 HIV结构蛋白 p17、p24 和 gp41 直接结合，但与 HIV 结构蛋白gp120 或HIV ssRNA 之间未检测到相互作用［24］。随着sTLR2浓度水平的升高，gp41诱导的IL-8表达受到显著抑制，p17 诱导的细胞活化水平降低［30］。sTLR2 浓度水平与疾病进展标志物 p24 含量呈正相关，同时HIV 感染患者体内α-防御素水平、Pam3CSK4 含量与母乳中的病毒负荷均可影响sTLR2 的分泌水平［30］。此外，sTLR2 也可以通过与HIV-1 结构蛋白结合，减少NF-κB 依赖性细胞活化，进而抑制HIV-1受体CCR5表达，并且这种抑制作用随着sTLR2 浓度升高而增强，从而显著减弱HIV-1感染［32］。同时，sTLR2 浓度水平与感染 HIV-1 的母乳中的IL-15 含量密切相关。随着机体内sTLR2 浓度水平增加，IL-15分泌增多，NK 细胞的杀伤作用和繁殖得以加强，使HIV 复制得到有效控制，其机制类似于TLR2 依赖性促炎症因子产生机制以及暴露于HSV 包膜糖蛋白中巨噬细胞释放IL-15 的机制［30］。

3 母乳中不同sTLR2片段与HIV的作用

在LEBOUDER 等［21］研究中，血浆和母乳及单核细胞培养上清液中共发现6 种sTLR2 片段，分别是32、36、40、66、70 和 83 kD 多肽。TLR2 的未加工形式的分子量约为90 kD，人TLR2 的细胞外结构域约为64 kD，并通过N-连接的糖基化增加至84 kD，因此母乳中的sTLR2 多肽是来自整个TLR2 分子或细胞外结构域的加工片段［33］。由此推测，83 kD 多肽可能对应于完整TLR2 细胞外结构域即完整sTLR2 片段，而其他较短多肽片段可能是由83 kD 多肽的进一步修饰水解产生的。

而在 HENRICK 等［24］研究中发现母乳中主要sTLR2片段是38 kD 和26 kD 多肽，乳腺和母乳中的多个细胞有助于26 kD sTLR2的生成，但是38 kD 形式的来源目前仍不清楚。数据表明38 kD sTLR2 的产量在产后随时间下降，并且在室温下容易降解，这一现象可能与婴儿的免疫系统成熟有关。sTLR2 38 kD 和26 kD 多肽片段通过非共价键相互结合，以sTLR2 蛋白复合物的形式抑制细菌PAMPs 诱导的促炎症细胞因子产生感染和无细胞R5 HIV-1感染，有助于减少HIV-1向婴儿的垂直传播［24］。这一点在体外实验中也得到了验证——使用免疫中和和免疫耗竭的方法将母乳中sTLR2 去除，将无细胞的R5 HIV-1 与含sTLR2 和不含sTLR2 的母乳上清液孵育并感染TZMbl 细胞发现，与不含sTLR2 的上清液相比，含有sTLR2 的细胞上清液中IL-8 的含量显著降低，当使用 TLR2 mAb 中和 sTLR2 时，IL-8 的含量显著增加，并且sTLR2 浓度越高，IL-8 含量降低越明显［30］。同样用不含sTLR2母乳进行体外免疫印迹实验发现，Pam3CSK4 可使细胞中IL-8 分泌显著增加。由此可见sTLR2 还与抑制Pam3CSK4 诱导的炎症有关，对婴儿健康和预防HIV 母婴垂直传播至关重要［24］。

4 sTLR2对HIV治疗的作用

在HIV的治疗过程中sTLR2可作为良好的标记物从而反应治疗效果。随着HIV 感染患者的单核巨噬细胞分泌sTLR2 的增加，sTLR2 含量与其他炎症标记物，如 TNF-α、IL-6 和 IL-1Ra，浓度水平呈正相关，这一点说明sTLR2 提高了HIV 感染患者免疫激活［34］。sTLR2 浓度水平的升高反映出 sTLR2 可有效抑制 TLR2 与 HIV-PAMP 的结合，通过 ELISA 或Western blot 对体液中sTLR2 的表达水平进行检测，在未来对HIV患者的治疗和HIV感染的预防有重要作用［24，30，34-35］。

5 结语

sTLR2 在HIV 发病机理中发挥重要作用，当HIV病毒感染机体后，sTLR2可与HIV-1病毒表面结构蛋白 p17、p24 和 gp41 直接作用，与 TLR2 竞争结合配体，抑制下游NF-κB 信号通路活化和炎症反应，增加 IL-15 产生，减少 IL-8 分泌和 CCR5 表达。鉴于母乳中sTLR2 和免疫因子之间的密切关系，从而认为这些先天因素共同起作用，有助于抑制HIV病毒的感染和复制，并在预防HIV 母婴垂直传播和保护婴儿健康中发挥重要作用。此外，sTLR2 与其他免疫分子相互作用可能是预防易感人群HIV-1感染和HIV 治疗的关键。目前，sTLR2 在HIV 感染和治疗中以及在病毒感染过程中的免疫调节作用仍然知之甚少，并且在中国这方面的研究还未见报道。然而，越来越多的证据表明免疫系统可以使用一系列可溶性分子来抵御病毒感染。通过sTLR2直接与HIV-1 蛋白的相互作用，可以推测sTLR2 可以至少通过以下两种可能的方式抑制病毒感染：①sTLR2 直接识别病毒表面蛋白，与之结合后并阻碍病毒-宿主细胞膜融合以减少病毒的入侵和感染；②sTLR2 以剂量依赖的方式显著抑制了病毒诱导的TR2依赖性NF-κB信号传导通路的激活和后续细胞因子的分泌。sTLR2在以HIV 为代表的病毒感染中的抑制作用为病毒免疫疗法和病毒相关疫苗制备提供新的方案，为病毒在人体内的发生发展和治疗预防提出新的思路。