衣原体颠覆宿主细胞固有免疫研究进展①

张荣荣 高 哲 贾天军 （河北北方学院临床检验诊断学重点实验室，张家口075000）

衣原体是一类专性细胞内寄生的病原微生物，其中对人致病的主要是沙眼衣原体（Chlamydia tra⁃chomatis，Ct）、肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，Cpn）和鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci，Cps）。据世界卫生组织最新统计，Ct 是导致细菌性传播疾病的主要病原菌，每年新增病例为1.27 亿［1］。证据表明，Ct感染后人类免疫缺陷病的传播风险增加了3~4 倍，更有研究表明其与人类乳头瘤病毒相关的宫颈癌有关［2］。Cpn 是一种呼吸道病原体，可引起鼻窦炎、咽炎、支气管炎和社区获得性肺炎，并与多种慢性炎症疾病有关，如动脉粥样硬化、迟发性痴呆和关节炎［3］。Cps 感染禽类，也可传播给人类，导致人畜共患病［4］。

衣原体感染宿主细胞后，会产生多种效应分子，激活宿主固有免疫和适应性免疫反应。因此，衣原体建立了多种机制防止细胞内应激或免疫系统导致的宿主细胞死亡。固有免疫是抵御衣原体入侵的第一道防线，维持衣原体在细胞内持久存活的关键是破坏宿主的固有免疫反应。现就衣原体对宿主固有免疫防御的最新进展进行综述。

1 干扰NF-κB信号通路

NF-κB 作为主要的诱导转录因子，存在于大多数动物细胞并且作为固有免疫反应的一部分负责调节基因转录。衣原体通过各种策略干扰NF-κB的功能：阻碍 NF-κB 抑制蛋白 IκB 的降解以及防止NF-κB 进入细胞核，从而抑制 NF-κB 转录。Ct 编码两种具有去泛素化（DUB）活性的蛋白：ChlaDub1（CT868）和 ChlaDub2（CT867）。ChlaDub1 与 NF-κB的抑制亚基IκBα 以及两个含氰基的保护嘧啶共价结合，这个复合物抑制IκBα 泛素化和退化，将其稳定在宿主细胞质。ChlaDub1 的异位表达虽然不干扰NF-κB 信号通路的上游组件但会阻碍通路的下游复合物，抑制NF-κB 的激活［5］。在输卵管模型中，Ct通过Wnt信号通路抑制由干细胞标记物嗅素结构域家族蛋白 4（OLFM4）引起的 NF-κB 的激活［6］。此外，Ct 尾部特异性蛋白酶（CT441）和CPAF 也参与NF-κB 信号通路的抑制。CPAF 会切断 NF-κB 通路p65/RelA 的组分，有效抑制感染细胞中的免疫应答反应［7］。XIONG 等［8］报道 Cpn RIPK3 启动子区域的亚甲基化会增加RIPK3 的表达，从而导致程序性坏死 和 NF-κB 转 录 因 子 的 激 活 。 WOLF 等［9］报 道Cpn0236 会结合细胞质中的 NF-κB 激活剂 1（Act1）并且改变其分布，Act1 分布的改变会抑制IL-17 受体招募Cpn0236，使Cpn 在IL-17 刺激的细胞中抑制由IL-17引发的NF-κB激活。总之，衣原体对NF-κB的抑制似乎是削弱宿主免疫反应的一个主要机制，并且促进衣原体长期生存。

2 干扰炎症反应

衣原体一旦被固有免疫系统识别，就会引发炎症。炎症过程对衣原体的清除至关重要，但也可能促进衣原体的持久性从而增加宿主的发病率。上皮细胞是衣原体感染的首选细胞类型，可诱导趋化因子和细胞因子分泌，导致白细胞的募集和细胞炎症反应增强［10］。Ct 感染上皮细胞会刺激NLRP3/ACS 炎性小体形成，此外，T3SS 复制和分泌到宿主细胞质可引起K+外流和线粒体活性氧（ROS）的产生，这有助于Caspase-1 过程激活炎症小体。RNAi技术敲低NLRP3/ASC 可阻止细胞Caspase-1 的激活，并提出Caspase-1 参与衣原体脂质的获取，这对衣原体的生存至关重要［11］。虽然Ct 激活Caspase-1并不能诱导IL-1β 的分泌，但似乎是上皮细胞衣原体生长所必需。

虽然炎症反应对于衣原体的清除是必要的，但慢性炎症引起的长期损害在衣原体疾病中经常可见。衣原体通过抑制促炎细胞因子的产生来协调固有免疫反应，促进衣原体在不同情况下的持久性。IL-10被认为是一种抗炎细胞因子，通过抑制衣原体感染免疫反应中的促炎分子，在抑制免疫反应中发挥关键作用。AZENABOR 等［12］发现 Ct 和鼠型衣原体（Chlamydia muridarum，Cmu）均可诱导感染的巨噬细胞和树突状细胞（DC）产生IL-10，抑制促炎因子分泌。与体外研究结果相似，HAKIMI 等［13］还测定了Ct 感染患者精液和血清中IL-10 的表达增加。此外，miRNA-155 在Ct 感染中上调并与炎症的严重程度相关，可通过靶向MYD88这一关键的炎症通路适应分子而负调控炎症，从而为衣原体调控miRNA对抗炎症反应提供依据［14］。

3 干扰干扰素（IFN）途径与自噬

3.1 干扰IFN 途径 IFN 是免疫系统的一个重要元素，有助于多种病原体的清除，包括病毒、细菌和寄生虫。Ⅱ型IFN 也称IFN-γ，可提高DCs和巨噬细胞的抗原递呈能力，促进细胞内病原体的清除。IFN-γ 是抗菌素防御的主要介质，在衣原体感染清除中发挥作用。COSSÉ 等研究表明，在体外培养的条件下，IFN-γ可导致细胞内衣原体的改变［15］。

衣原体能很好地适应宿主的免疫系统，对不同物种宿主的防御机制不同，这些对感染反应的差异可以用人和小鼠细胞间IFN 信号传导的差异来解释。与Cmu 感染相比，Ct 攻击小鼠会导致感染减弱，使感染迅速清除。在人和小鼠上皮细胞，IFN-γ会通过p47GTP 干扰机制或降解色氨酸的方式影响衣原体的生长。在人上皮细胞，IFN-γ 会诱导产生吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO），这种酶催化色氨酸降解为N-甲酰犬尿氨酸，从而使衣原体缺乏这种必需氨基酸。IDO 介导的色氨酸缺失可阻止微生物向感染性EBs 分化，从而抑制衣原体复制［16］。然而在反复感染Ct 的女性生殖道中，犬尿氨酸和犬尿氨酸/色氨酸比值明显升高［17］。在小鼠上皮细胞，Ct 感染后产生的IFN-γ虽不会诱导IDO表达但会诱导IFN-γ刺激因子（ISGs）的表达。RADOMSKI 等［18］研究表明，衣原体通过逃避IFN-γ 在3 类固有淋巴细胞（ILCs）中的作用来实现在结肠的长期定植。不同的衣原体血清型和种类对IFN-γ 的治疗效果展现出一系列的敏感性，例如，IFN-γ 对Ct的抑制取决于实验中使用的人细胞系，这可能是由于宿主细胞的内在差异导致。但是，即使小鼠中存在IDO，这种效应也没有在小鼠中发现。人类衣原体菌株而不是Cmu，会通过抑制干扰素的产生或抑制其下游基因产物来避免这种反应以维持在真核细胞的生存。

导致生殖道疾病的Ct 表达一种功能性色氨酸合成酶（trpRBA），该酶通过利用微生物群提供的吲哚分子作为色氨酸合成的底物，克服IFN-γ 诱导的色氨酸缺失，而导致眼部疾病的Ct对IFN-γ敏感［19］。由于家畜衣原体（Chlamydia pecorum）也表达trp 基因，在牛肾上皮细胞，牛IFN-γ 不能抑制家畜衣原体但能抑制Ct，说明家畜衣原体在其自然宿主体内克服IFN-γ诱导的色氨酸缺失［19］。然而，由于IFN-γ引发了不同的机制，两个物种都未能在用IFN-γ 处理的小鼠McCoy 细胞中生长。Cpn 通过活化一种特异性蛋白酶降解肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3），TRAF3 又会催化干扰素调节因子3（IRF3）的磷酸化，从而抑制IFN-β的产生［20］。同时，Ct 会通过 TepP（CT875）限制Ⅰ类磷酸肌醇 3 激酶（PI3K）来调节细胞信号通路和膜转运，抑制IFN 的产生［21］。Ct 和 Cpn 还可以通过促进鸟氨酸脱羧酶（ODC）表达和降低NO 合成酶（iNOS）的水平操纵多胺途径和抑制NO 合成，从而逃避先天免疫［22］。然而，其精准的分子机制尚未可知。

3.2 干扰自噬 自噬是发生在大多数细胞溶酶体内的一种生理降解过程，它主要维持细胞内稳态和选择性清除细胞内的细菌或病毒。衣原体能够感染多种细胞，包括上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞。在不同的衣原体物种之间，细胞内存活和复制的能力差异极大。宿主细胞释放的EBs可被巨噬细胞吞噬，Cpn 能够在巨噬细胞中复制繁殖并产生感染性后代，而Ct和Cps不能在这些免疫细胞中复制，因为它们的包涵体各自对溶酶体标记物（LC3 和Rab7）呈现阳性［23］。衣原体对于抑制宿主自噬途径的条件高度敏感，MAP-LC3 和钙网蛋白与包涵体膜的紧密结合仍然表明宿主自噬在衣原体发病机理中的潜在作用。

Ct感染小鼠上皮细胞产生的IFN-γ 可诱导表达ISGs。ISGs 超家族包括鸟苷酸结合蛋白（GBPs）和免疫相关的 GTPases（IRGs）如 GBP1、GBP2、Irga6 和Irgb10能够诱导自噬和感染的清除。在体外培养Ct的条件下，经IFN-γ 治疗后，缺乏Irgb10 的小鼠成纤维细胞（MEFs）中Ct数量增加，而缺失Irga6 的MEFs对衣原体的影响尚存在争议。AL-ZEER 等［24］研究表明，缺失Irga6 对衣原体无影响，而其他研究显示缺失Irga6 限制衣原体生长。在没有IFN-γ 的情况下诱导自噬并不限制MEFs 中Ct 的生长，这表明ISGs 对包涵体自噬系统识别的重要作用。BEL⁃LAND 等［25］研究表明，Cmu 可以通过分泌 TC438 蛋白使IRGs 失活，来防止IFN-γ 诱导的自噬对包涵体的破坏。该效应蛋白与YopT 的半胱氨酸蛋白酶结构域和大肠杆菌毒素的UDP 糖基转移酶结构域具有同源性，两者均通过去除脂质修饰而使GTPase失活。然而，每种环境中所涉及的分子机制尚未阐明。

4 干扰宿主细胞凋亡

在衣原体复制的早期阶段，衣原体通过抑制促凋亡途径和激活促存活途径抑制细胞凋亡，在复制的中后期则诱导细胞凋亡使其得以繁殖。衣原体利用多种机制阻止细胞凋亡：衣原体依赖性抗凋亡因子-细胞色素c 从线粒体释放的抑制作用；PI3K/AKT 介导的鼠双微体 2（MDM2）-p53 途径在 Ct 感染的抗凋亡作用［26］；14-3-3β 结合固定在包涵体膜对BCL-2 相关的细胞死亡激动剂（BAD）的隔离作用；抗凋亡抑制剂（IAP）同源物、BAG 家族分子伴侣调节因子 1（BAG1）及 BCL-2 家族成员 MCL-1 基因的上调作用［27］。

据报道，衣原体会通过与成纤维细胞生长因子受体（FGFR）或酪氨酸激酶受体（RTKs）和肝细胞受体A2（EPHA2）的相互作用激活促存活途径。衣原体对这些通路的调控似乎是激活宿主细胞内促存活基因和表达抗凋亡因子的核心，使衣原体能够诱发复制所需的生存信号。ZHONG等［28］研究表明，抑制由促凋亡蛋白（BAX 和BAK）激活介导的宿主细胞凋亡途径是衣原体物种的共同特性。例如，持续的Cps 感染通过下调BCL-2 家族的促凋亡蛋白（如tBid 和Bim）和上调抗凋亡蛋白Mcl-1 抑制宿主细胞的凋亡，从而延长其生存周期［27］。在Ct 感染的上皮细胞中，肿瘤坏死因子（TNF）可通过Caspase-8 依赖的程序性细胞死亡途径触发宿主细胞的凋亡，同时会在受体内化水平上抑制TNF 诱导的凋亡，使非凋亡信号保持完整。Cmu 也对IFN-γ 诱导的程序性细胞死亡和相关的脑内病原体的破坏产生抵抗［29］。SIXT 等［30］证明 Cpos（CT229）通过与 GTPaes Rab4 分子相互作用靶向STING，抑制宿主细胞过早死亡以利于包涵体在宿主细胞内完成发育周期。FOSCHI等［31］证明了Caspase-1参与Ct诱导的细胞死亡，可能导致宿主炎症反应和组织损伤。与感染D血清型的细胞相比，被L2 血清型感染的细胞表现出更高的Caspase激活效应，表明该血清型特异性激活了细胞凋亡途径，并可能解释了L 血清型有更大毒力。与此同时，衣原体也可感染巨噬细胞和免疫细胞引起细胞凋亡，阐明了Caspase-1介导的细胞凋亡过程的重要作用。这些能力可通过创造免疫抑制环境来阻止细菌清除，这有利于衣原体在细胞内生存。

5 总结与展望

综上所述，衣原体专性胞内的生活方式使其进化出各种各样的策略来对抗宿主的免疫反应，并为其生存建立一个有利的生态位。因此，衣原体干扰免疫识别、炎症、凋亡和自噬的多种主要信号通路也就不足为奇。尽管无法用经典的遗传工具来研究这些古老的生物体，但近年来测序技术、RNAi 干扰技术和基因组学方法的进展，拓宽了人们对衣原体生物学的理解。在实验中观察到衣原体物种间广泛的DNA 交换以及衣原体质粒转化技术，有理由相信在不久的将来会对衣原体发病机制的分子理解取得重大进展。