表观遗传修饰在哮喘中的作用①

滕方舟 魏 颖 王文倩 崔 洁 吾尼且木·吐拉克 董竞成

（复旦大学附属华山医院中西医结合科，上海200040）

传统观点认为，哮喘是一种常见的由免疫和呼吸功能障碍引发的呼吸道疾病，多与过敏有关［1］。全球哮喘防治创议（global initiative for asthma，GINA）将哮喘定义为一种异质性疾病，其异质性特点由哮喘复杂的病理生理学变化所决定［2］。随着对哮喘发病机制的理解不断加深，医学界逐渐形成一种新的认识，即哮喘不再被简单地认为是“单一”的疾病，而是一种包含多种临床表型和病理生理学机制的综合征［3-4］。根据哮喘不同表型和病理生理学特征确定最具针对性的治疗方案，可能是今后临床治疗哮喘的趋势。

表观遗传学概念最早由WADDINGTON 提出，其通常被用于描述调节基因表达的可遗传性变化，而不涉及DNA 核苷酸序列本身改变［5-6］。随着遗传学和基因组学领域研究进展，多种调控细胞功能的表观遗传修饰已得到证实，这些基因调控过程不仅维持细胞正常功能，也参与疾病发生［7］。经典表观遗传修饰主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰和微小RNA（microRNA，miRNA）。多项证据表明，这些表观遗传修饰所介导的基因调控过程与哮喘复杂的病理生理学变化密切相关，可能是影响哮喘异质性的重要机制之一［8-11］。因此，本文将详细介绍上述表观遗传修饰的作用机制，并重点关注其在哮喘病理生理学变化中的作用与特点，最后讨论表观遗传修饰的调控作用如何为哮喘治疗提供新选择。

1 表观遗传学作用机制

1.1 DNA 甲基化 DNA 甲基化是被研究最多的一种表观遗传学机制，指胞嘧啶的第5位碳原子在DNA甲基转移酶催化下共价结合1 个甲基基团（-CH3），生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），从而实现甲基化修饰的过程［12］。这种DNA 修饰通常发生于1 个富含CpG 位点的区域（即CpG 岛），CpG 位点指DNA 某个区域的碱基序列以5'-胞嘧啶（C）-磷酸二酯键（p）-鸟嘌呤（G）-3'形式出现，区别于CG（位于互补DNA 双链上的碱基对）［13］。简言之，DNA 甲基化就是在CpG 位点的C 碱基中添加-CH3，从而生成5mC 的过程。5mC 是一种可靠的表观遗传学标记，其出现代表DNA甲基化发生。

CpG 岛位于或靠近基因转录起始位点，其CpG位点的甲基化水平影响基因表达调控（但不改变DNA 序列），如CpG 岛高甲基化与基因转录抑制相关，低甲基化则导致转录活跃［7，14-15］。DNA 甲基化与基因表达密切相关，目前已被广泛用于疾病机制及治疗研究。

1.2 组蛋白修饰 组蛋白是真核细胞核中发现的一类碱性蛋白，其与DNA 共同组成核小体（即染色质基本结构单位）［16-17］。一般而言，核小体由 147 个碱基对缠绕1 个八聚体而成，其中八聚体包含4 类各2 分子组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4）［14］。多数组蛋白都具有1个球状结构域和游离于自身核小体外的N 端尾状结构，游离的N 端尾状结构含有多个氨基酸残基（如赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸等），在特定酶催化作用下，这些残基分别与相应生物化学官能团（如乙酰、甲基、磷酸根、泛素等）共价结合，从而发生相应的翻译后修饰（如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等）［14，18-19］。目前，已经发现的组蛋白N端残基共价修饰包括：赖氨酸乙酰化、泛素化、类泛素化、生物素化；赖氨酸、精氨酸甲基化；丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化等［20］。

组蛋白修饰大多具有调控基因表达作用，如组蛋白乙酰化可降低组蛋白分子与DNA，或相邻核小体间的亲和力，松解染色质结构，使染色质易于被转录因子和染色质重塑因子等接近和访问，从而促进基因转录和表达，因此，组蛋白乙酰化通常与基因激活相关［21］。组蛋白甲基化既可与基因抑制有关，也可与基因激活有关，取决于组蛋白N端发生甲基化的氨基酸残基位置和共价结合的甲基数，如组蛋白H3 第4 位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3）可激活转录，而组蛋白H3 第9 位赖氨酸二甲基化（H3K9me2）则限制转录［22-23］。

综上，组蛋白修饰可通过改变染色质结构或招募生物化学官能团影响基因表达。与DNA 甲基化相比，组蛋白修饰不影响DNA 序列，但组蛋白修饰更为复杂，其涉及对染色质结构和转录活性的调控，在基因表达中发挥重要作用，这种调控作用也可能是疾病发生的重要原因之一。

1.3 miRNA 介导的表观遗传修饰 miRNA 对基因表达的调控被认为是影响哮喘发病的另一重要表观遗传学机制。miRNA是由21~23个核苷酸组成的短单链非编码RNA，其通常作为一类基因转录后（mRNA）水平的负向调节因子，可下调或抑制由靶RNA翻译的蛋白水平［24］。

具体而言，miRNA 通过互补序列与靶mRNA 3′非翻译区（3′UTR）结合抑制翻译，并使mRNA 脱腺苷化和5′端脱帽，从而导致mRNA稳定性下降或/和降解，最终抑制蛋白表达［23，25］。每个 miRNA 都可直接或间接调控多个靶基因，而每个基因又可受多个不同miRNA 调控，从而形成一个复杂的基因调控网络［26］。据估计，哺乳动物中约50%蛋白编码基因受 miRNA 调控，而人体中约为 33%［24，27］。因此，miRNA 在调节机体正常生理活动与功能中起重要作用，同时，其表达异常与疾病发生发展密切相关。

2 哮喘的表观遗传学调控

2.1 哮喘的一般病理特征 哮喘以支气管高反应性、气道炎症及气道重塑为主要病理特征［28-29］。哮喘炎症反应可引起支气管对各种刺激反应性增强，导致支气管高反应性［30］。另一方面，气道重塑可由免疫细胞释放的促炎细胞因子，或IgE 直接作用于平滑肌细胞，或非免疫刺激等因素诱导［31］。通常，哮喘最初发病特点为平滑肌收缩和气道炎症引起的可逆性气流受限，当疾病转入慢性期，气道结构和功能会发生病理改变，如气道重塑：平滑肌和黏膜下腺体增生和肥大，细胞外基质沉积和血管生成等［32-33］；上皮细胞功能异常：常驻干细胞和基底细胞比例提高、杯状细胞增生和黏液分泌过多，纤毛细胞减少等［34-35］。另外，哮喘的肺部病理改变不仅与气道上皮细胞（airway epithelial cells，AEC）及气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMC）功能失调有关，还涉及单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞等免疫细胞间高度复杂的相互作用，以及多种生物活性物质介导［8］。可见，气道结构细胞及相关免疫细胞在哮喘发生发展中起重要作用。

2.2 哮喘的表观遗传学特征 表观遗传修饰的作用主要与基因表达调控有关，且多种细胞发育、分化和功能均依赖于这些表观遗传调控机制［7，10，13，36］。不同类型细胞可表现出各具特征的表观遗传学模式。由于哮喘发生发展与多种细胞功能异常密切相关，因此，笔者将围绕哮喘发病中起关键作用的若干种细胞，阐述哮喘的表观遗传学特征及调控机制。

2.2.1 AEC AEC属于黏膜层，位于外界环境与黏膜下层之间，是气道抵御吸入性有害物质和空气变应原的第一道屏障［37］。最新研究证实，哮喘患者AEC 中具有大量表观遗传学变化，其IL-33 和嗜酸性粒细胞趋化因子3（eotaxin-3）DNA 甲基化水平明显降低［38］。IL-13 是哮喘气道炎症和气道重塑的关键细胞因子，研究发现，IL-13 诱导的AEC 中基因组DNA 甲基化模式明显改变，且这改变主要发生于哮喘相关基因附近区域，如中性粒细胞胞浆因子2（NCF2）、基质金属蛋白酶14（MMP-14）等，推测这些基因的低甲基化水平可能参与哮喘病理改变［39］。儿童哮喘患者鼻腔上皮细胞中，哮喘相关基因如花生四烯酸15-脂氧合酶（ALOX15）、钙蛋白酶14（CAPN14）、组织蛋白酶 C（CTSC）、凝溶胶蛋白（GSN）、神经营养性酪氨酸激酶2 型受体（NTRK2）、血管假性血友病因子（vWF）及一些免疫和细胞外基质基因等均出现大量DNA 甲基化标记［40］；通过观察哮喘患者与健康人群AEC 表观遗传差异发现，哮喘患者AEC 中，组蛋白H3 第18 位赖氨酸的乙酰化（H3K18ac）、组蛋白H3 第9 位赖氨酸的三甲基化（H3K9me3）水平明显增高，其中，H3K18ac 特异性改变与表皮生长因子受体（EGFR）、转录因子（Delt⁃aNp63 与STAT6）转录起始位点相关，可导致哮喘AEC 中 EGFR、DeltaNp63 及 STAT6 表达增加，从而参与哮喘发病［41］；另外，miRNA 可通过调控特定细胞因子表达参与AEC凋亡和增殖过程。B细胞淋巴因子2（Bcl-2）是一种抗凋亡蛋白，其凋亡抑制作用通常被认为是癌症发生发展的关键［42］。研究表明，miRNA-23a 可抑制 Bcl-2 表达，从而促进 AEC 凋亡，而AEC凋亡与哮喘气道重塑密切相关［43］。

2.2.2 ASMC ASMC 是气道高反应性的主要效应细胞，同时也被认为与气道重塑密切相关。多项证据表明，哮喘患者ASMC 中存在某些基因的特异性表观遗传变化，如磷酸二酯酶4D（PDE4D）是一种调节细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平的特异性磷酸二酯酶，控制其表达的基因已被鉴定为哮喘易感基因［44-45］。哮喘患者 ASMC 中发现，PDE4D 基因启动子CpG 位点表现出低甲基化特征，该特征可导致PDE4D 表达增加，进一步将甲基化的寡核苷酸引入PDE4D启动子上的CpG位点，使该基因DNA甲基化水平提高，以此反证PDE4D 低甲基化引起的哮喘ASMC 功能异常，结果发现，PDE4D 甲基化水平提高可逆转ASMC 异常功能，其不仅可降低哮喘ASMC中 PDE4D 表达，提高 cAMP 水平，从而抑制 Ca2+水平异常升高，还可降低Ca2+信号通路下游效应因子磷酸化水平（如肌球蛋白轻链激酶），从而降低哮喘ASMC 增殖和迁移［44］。CXC 趋化因子配体（CXCL）8又名IL-8，是一种强效中性粒细胞趋化因子，可募集中性粒细胞进入气道，导致激素抵抗性的嗜中性粒细胞气道炎症［46-47］。研究发现，哮喘患者分离的ASMC 中，CXCL8 蛋白和 mRNA 表达显著增高［48］。为阐明CXCL8 在哮喘患者中分泌增多的内在机制，进一步研究哮喘患者ASMC 中CXCL8 基因的表观遗传变化，发现CXCL8启动子处组蛋白H3K18乙酰化大量增加，而与CXCL8基因相关的DNA甲基化并无明显改变［47］。此外，研究证实miR-139-5p 可通过下调染色质重塑因子（Brg1）基因表达，抑制哮喘患者ASMC增殖，并促进其凋亡，提示miR-139-5p参与气道重塑的调节过程［28］。

2.2.3 单核细胞 单核细胞是外周血白细胞，其在炎症发生时，可通过血液循环聚集至炎症局部，并分化成巨噬细胞或树突状细胞，参与宿主免疫反应［49］。一项研究评估了不同炎症表型哮喘患者外周血中单核细胞DNA 甲基化差异，通过与健康对照组比较发现，嗜酸粒细胞性哮喘（EA）、寡细胞性哮喘（PGA）、中性粒细胞性哮喘（NA）患者单核细胞中分别有413、495、89 个差异甲基化 CpG 位点，而EA、PGA 和 NA 患者单核细胞中分别有 223、237 和 72 个位点存在显著高甲基化，其中，又有9个基因的高甲基化是这3种表型哮喘共有的特征［50］。这些不同表型哮喘患者的DNA 甲基化特征可能有助于理解哮喘发病机制，但其在哮喘中的确切作用尚未明确。

2.2.4 嗜酸性粒细胞和中性粒细胞 嗜酸性粒细胞参与哮喘气道重塑和高反应性等病理过程［51］。中性粒细胞及其相关蛋白酶持续性增多对气道产生极为不利的影响，如损伤和阻塞气道、黏液分泌过多和气道重塑，常与哮喘急性加重及难治性哮喘有关［52］。最新研究表明，miRNA 可通过影响特定细胞因子表达调控这些粒细胞迁移和浸润，如黏附分子P 选择素（P-selectin）、eotaxin-3、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）和血小板生成素受体（MPL）均在嗜酸性粒细胞迁移中起重要作用，miRNA-1 可靶向抑制这些生物活性分子基因表达，从而抑制气道嗜酸性粒细胞浸润［53］。也有研究发现，哮喘患者AEC中，miR-146a 表达明显减少，同时趋化因子IL-8 和CXCL1 增加，推测 miR-146a 下调可能减弱 IL-8 和CXCL1 基因抑制，使趋化因子表达增加，从而促进中性粒细胞向肺组织迁移，加重哮喘炎症反应［54］。

2.2.5 T 淋巴细胞 初始CD4+T 细胞在抗原和所处微环境影响下，可分化为不同亚型效应T 细胞［20，55］。T细胞分化受多种表观遗传学机制调控，如DNA 甲基化、组蛋白修饰等。初始CD4+T 向Th2 细胞分化与 IL-4、IL-13 DNA 甲基化相关，而 Th1 细胞分化则与T-框蛋白21、γ-干扰素（IFN-γ）DNA 去甲基化相关［56-57］。甲基化CpG结合域蛋白2（MBD2）是一种表观遗传调控因子，可特异性结合于靶基因启动子区域，通过募集其他分子介导组蛋白修饰，从而改变染色质结构，调控靶基因表达［58-59］。干扰素调节因子4（IRF4）作为Th17 细胞分化的重要调控因子，可由IL-1β 和IL-6 诱导表达，参与多种免疫疾病［60］。研究表明，MBD2 在哮喘患者外周血 CD4+T细胞及重症哮喘小鼠肺组织中高表达，且可通过促进IRF4 生成诱导Th17 细胞分化和IL-17 分泌，从而参与哮喘发病［59］。由此可见，MBD2 通过某种组蛋白修饰间接影响Th17细胞分化，但具体通过调控哪些基因位点及何种组蛋白修饰起作用有待进一步研究。

2.2.6 B 淋巴细胞 哮喘的过敏性炎症主要由B 细胞产生的IgE 介导。此外，B 细胞还可分泌其他细胞因子如血小板反应蛋白1（TSP-1）调节哮喘炎症反应［61］。TSP-1 是诱导外周免疫耐受和调节免疫的重要分子，有助于维持机体免疫稳态［62］。TSP-1+B细胞是外周血B 细胞中表达TSP-1 的一类B 细胞亚型，对其他效应免疫细胞具有免疫抑制作用［63］。研究显示，哮喘患者外周血TSP-1+B 细胞明显减少，其机制可能为miR-98 抑制B 细胞TSP1 表达，从而导致哮喘患者免疫功能失衡［61］。

2.3 表观遗传修饰对哮喘相关信号通路的调控

表观遗传修饰可通过调控细胞相关信号通路影响哮喘发生发展。Wnt 信号通路由一类复杂糖蛋白（Wnt 配体）家族及其受体、下游信号分子组成［64］。研究发现，中性粒细胞性哮喘患者外周血单核细胞中，Wnt2 配体、低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）、分泌型卷曲相关蛋白1（sFRP1）等多个基因DNA 甲基化修饰出现异常，而其均为Wnt信号通路相关基因［50］。Wnt2配体是信号转运蛋白，可将细胞外信号传递至细胞内［65］。LRP5是一种辅助受体，可与 Wnt2 配体结合参与信号转导［66］。sFRP1 作为细胞外Wnt配体拮抗剂，参与Wnt信号通路调控［50］。多项证据表明，Wnt 通路激活可抑制肺部炎症和过敏反应［67-68］。另外，该通路也与胚胎期肺发育、哮喘气道重塑过程密切相关［66］。因此，上述基因DNA 甲基化修饰异常导致相应蛋白表达失调，从而引起Wnt 信号通路功能紊乱，可能是哮喘气道炎症相关的表观遗传学机制之一。

最新研究表明，组蛋白H3 第27 位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K27me3）在缓解哮喘症状及改善气道平滑肌重塑等方面具有重要作用。H3K27me3 可抑制基因转录，相反，由相关去甲基化酶介导的H3K27me3 去甲基化则能激活基因转录［69-70］。研究发现，哮喘小鼠肺组织中H3K27me3阳性细胞减少，并在血小板衍生生长因子PDGF（或转化生长因子TGF-β）诱导的人ASMC 中也发现H3K27me3水平下降，以及蛋白激酶Akt 和JNK（或转录激活因子Smad3）蛋白磷酸化水平增高，同时观察到PDGF（或TGF-β）诱导的ASMC 增殖和迁移能力增强（或收缩蛋白表达增多）。进一步研究发现，H3K27 去甲基化酶抑制剂可逆转上述小鼠及ASMC 中出现的异常变化［70］。由此可见，去甲基化酶抑制剂之所以能发挥作用可能由于其抑制H3K27me3 去甲基化，维持H3K27me3 正常水平，从而改善哮喘小鼠气道高反应性、气道炎症及重塑；另外，H3K27me3 还可通过抑制PDGF/Akt/JNK 信号通路减弱ASMC 增殖和迁移能力，抑制 TGF-β/Smad3 信号通路下调 ASMC 收缩蛋白表达，从而改善ASMC重塑。

表观遗传修饰还可调控免疫细胞中固有免疫相关信号通路影响哮喘疾病发展。研究发现，重型哮喘患者肺泡巨噬细胞中Toll样受体7（TLR7）表达明显降低，而 miR-150、miR-152 和 miR-375 表达则明显增多。进一步研究发现，这3 种miRNA 共同抑制 TLR7 表达，并导致干扰素（IFN）生成减少［71］。IFN 是一类抗病毒细胞因子，外来病毒的危险信号被模式识别受体TLR7 识别后，可激活TLR7 介导的相关信号通路，诱导IFN 生成，从而抵御外来病毒入侵［72］。因此，上述 miRNA 对 TLR7 信号通路的抑制可导致固有免疫系统功能受损，这一机制也阐明为何重型哮喘患者病情加重常与呼吸道病毒感染有关。

3 表观遗传疗法在哮喘中的应用

3.1 在现代医学中的应用 近年针对疾病的表观遗传学调控机制形成了一种新的治疗方法，即表观遗传疗法，其在多种疾病（如肿瘤、心血管疾病、炎症性疾病等）治疗中展现出较大潜力［73-74］。目前，表观遗传疗法应用于哮喘治疗尚处于起步阶段，多项研究正致力于利用哮喘的表观遗传学特征开发成新的治疗靶点，如以催化表观遗传修饰过程的关键酶为靶点，筛选出一系列组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，如HDAC6 抑制剂Tubastatin A HCl可降低IL-4、IL-5 和总炎症细胞数，改善杯状细胞化生和上皮下纤维化，缓解气道炎症；HDAC8 抑制剂PCI-34051 则可减轻哮喘小鼠嗜酸性炎症和气道高反应性，改善气道重塑［75］。此外，也有研究验证了miRNA 拮抗剂的抗哮喘作用，如miR-21 拮抗剂可通过调控IL-12 表达激活信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）、锌指蛋白（GATA）等转录因子，促进Th1/Th2 平衡，从而减轻急性哮喘小鼠过敏性气道炎症［76］。值得注意的是，哮喘的表观遗传特征除可作为治疗靶点外，还可作为预测和诊断哮喘的生物标志物。如哮喘患者血清miRNA-1165-3p水平较健康人群显著升高，该指标检测的敏感性和特异性分别为83%和68.2%［77］。当然，表观遗传变化所致表达异常的基因或蛋白也可作为一类生物标志物。如研究发现，哮喘患者血液中Ⅱ型白介素1 受体（IL1R2）基因启动子具有高水平的甲基化特征，且这种特征与IL1R2 基因表达呈负相关，因此，IL1R2可作为哮喘表型的潜在生物标志物［78］。

3.2 在传统医学中的应用 传统医学在调控哮喘表观遗传学机制研究中也取得了一定进展。研究证实，右归丸胶囊可抑制哮喘小鼠肺组织炎症和嗜酸性粒细胞浸润，同时增强肺组织中多种HDAC（如HDAC7、HDAC9-11 等）活性，推测右归丸对哮喘的治疗作用可能涉及组蛋白去乙酰化过程，但右归丸对哮喘组蛋白去乙酰化修饰的调控具体影响哪些基因及相关信号通路尚不明确［79］。此外，多种天然草本植物提取物也被证实可通过影响表观遗传修饰发挥抗哮喘作用，如葶苈子乙醇提取物可减少哮喘小鼠肺部炎症细胞浸润和IL-4 产生，并下调血管内皮生长因子A（Vegfa）基因表达，上调原癌基因受体酪氨酸激酶（Kit）、长链脂酰辅酶A 合成酶4（Ac⁃sl4）等9 个基因表达，且这些基因的DNA 甲基化变化与其各自基因表达水平呈负相关，提示该药可通过调控上述基因DNA 甲基化水平发挥抗哮喘作用［80］；叉状头转录因子3（FOXP3）是调节性T淋巴细胞分化的主要转录因子，研究证实，白藜芦醇可通过下调miR-34a 使该miRNA 负向调控的FOXP3 表达增加，从而减轻哮喘小鼠肺部炎症［81］；也有研究发现，穿心莲内酯可抑制激素抵抗模型小鼠IL-27生成和气道高反应性，并能促进HDAC2 表达和总HDAC 活性，降低总组蛋白乙酰转移酶活性，对激素抵抗型难治性哮喘治疗具有一定启示作用［82］。

4 不足与展望

表观遗传学作为一种通过表观遗传修饰调控基因表达的机制，广泛应用于各种疾病研究。上述相关研究已证实表观遗传学机制参与哮喘发生发展，表观遗传修饰在多种细胞中的失调及其对相关信号通路的影响可能是哮喘表现出高度异质性的重要原因。此外，某些表观遗传学特征有望成为哮喘治疗靶点，或作为诊断哮喘特定表型的生物标志物，对临床具有指导意义，同时也有助于对哮喘发病机制理解。

尽管哮喘的表观遗传学领域近年取得了迅速发展，但仍存在不足。哮喘复杂的病理生理学变化导致的表型异质性是多种因素相互作用的结果，不难推测，哮喘发病可能涉及多种表观遗传修饰作用，且不同修饰间也可能存在相互作用关系，如不同类型细胞中表观遗传修饰间的相互作用，同一类型或单个细胞中不同表观遗传修饰间的相互作用等，目前有关这方面的作用机制仍知之甚少。加之哮喘具有大量表观遗传学特征，如何将其复杂的病理改变与这些特征一一对应，以及这些特征是否在哮喘发病中占有相同地位或存在先后主次之分等有待深入探究。

治疗方面，部分研究并未阐明药物所调控的表观遗传修饰具体与哪些基因位点相关，也未进一步验证药物治疗效果是否是同时调控多个表观遗传修饰过程的结果，且这些靶向表观遗传修饰药物疗效研究大多停留于实验室验证阶段，缺乏高质量临床证据支持。另外，各种表观遗传学特征究竟是哮喘发病的起因还是后果仍存在较大不确定性，为表观遗传疗法药物开发带来一定阻力，如药物靶向调控这些特征能否产生疗效，或靶向药物显现出来的疗效是否真的与干预的目标靶点相关等，因此，确定哪些特征与哮喘发病机制真正相关，也是未来的重要研究方向。