肿瘤相关中性粒细胞在肿瘤靶向治疗中的研究进展①

覃凤娴 刘小勇 陈 翔 （广西医科大学第四附属医院医学检验科，柳州545005）

炎症细胞在炎症性疾病中发挥重要作用。肿瘤作为一种慢性炎症性疾病，常常伴有大量炎症细胞浸润。中性粒细胞是最重要的炎症免疫细胞之一，与肿瘤的发生发展密切相关。在肿瘤微环境中，常常聚集有大量中性粒细胞，研究者将此类细胞称为肿瘤相关中性粒细胞（tumor associated neu⁃trophils，TANs）。目前，TANs 在肿瘤中的作用引起研究者的广泛关注，其对肿瘤的促瘤和抑瘤作用已被越来越多研究者认可［1］。利用TANs 的两面性靶向治疗肿瘤已成为肿瘤学研究领域的热点［2］。本文就近年来靶向作用TANs 治疗各种肿瘤的研究进展进行综述。

1 TANs对癌症结局的双重性

中性粒细胞是人类最丰富的循环白细胞，含有大量细胞毒性分子、蛋白酶和其他蛋白质，是抵御感染的第一道免疫防线［3］。在趋化因子作用下，外周血中的中性粒细胞被募集至肿瘤组织内，即TANs。类似于M1/M2 型肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤微环境中的TANs可分为N1和N2两种表型。其中，N1型具有抑制肿瘤发生发展的作用，其机制包括直接细胞毒作用、抗体依赖的细胞毒性作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）及激活其他免疫细胞等作用。N2型TANs则促进肿瘤细胞增殖转移，并抑制机体的肿瘤免疫，最终促进肿瘤进展。早在 1970 年，BUBENIK 等［4］和 GODLESKI等［5］就观察到TANs 对人膀胱肿瘤和大鼠乳腺癌具有抑制作用。后来，TAKASUGI 等［6］又发现，循环中的中性粒细胞对多种肿瘤细胞均具有细胞毒作用。在接下来的几十年里，大量报道表明TANs 在体外对癌细胞具有细胞毒性和细胞抑制作用。SOUTO等［7］报道称，将中性粒细胞直接转移到肿瘤组织后，肿瘤的生长减少了49%。随着研究的深入，研究者逐渐认识到，TANs在肿瘤发生的不同阶段发挥不同功能。ALBANESI 等［8］研究发现，如果在肿瘤发生的早期阶段将TANs 剔除，肿瘤细胞的生长速度明显加快；而在肿瘤发生的中晚期阶段，TANs 在肿瘤微环境的作用下发生功能改变，其释放的多种蛋白酶不仅抑制了肿瘤细胞凋亡，还促进肿瘤血管新生。以上提示TANs 主要在肿瘤发生发展的早期阶段发挥抗肿瘤作用，而在肿瘤晚期阶段，受肿瘤微环境的影响，TANs 发生功能的改变，其释放的细胞因子发生变化，从而发挥促进肿瘤进展作用。AEED 等［9］研究证实，在肿瘤发生的中晚期阶段，TANs 可分泌多种基质金属蛋白酶（matrix metallo⁃proteinases，MMPs），后者对基底膜有较强的降解能力，从而增强了乳腺癌细胞的转移潜能。RAKAEE等［10］对 536 例肺癌组织进行基因芯片技术分析，证实了肺腺癌患者体内TANs 数量与患者的不良预后密切相关。该结论在ZHANG 等［11］的喉癌研究中也得到证实。动物模型研究进一步证明，外周血中性粒细胞比例随着肿瘤的进展不断地增加，清除中性粒细胞后，肿瘤的发生受到显著抑制。以上诸多研究提示TANs 在肿瘤发生发展过程中具有抑瘤和促瘤的双重作用，靶向抑制TANs 的促肿瘤作用或诱导其抗肿瘤作用，可为肿瘤治疗提供新的策略。

2 靶向TANs治疗肿瘤

鉴于TANs 在肿瘤发生发展过程中发挥抑瘤及促瘤的双重作用，充分合理地利用其双重作用有可能为肿瘤的治疗提供新的思路和新的方法。将TANs 作为靶标治疗相关肿瘤，根据TANs 双重特性制定相应的肿瘤免疫治疗策略，如通过多种方式靶向抑制TANs 的促瘤作用从而达到控制肿瘤发生发展的目的；另外，充分增强或诱导TANs 的抗肿瘤作用也是抑制肿瘤进展的有效途径。

2.1 抑制TANs 募集至肿瘤微环境 TANs 以及循环中的中性粒细胞均来源于粒细胞样髓源抑制细胞（granulocytic-myeloid derived suppressor cells，GMDSCs）［12］。肿瘤细胞可产生多种强有力的中性粒细胞化学引诱剂和激活剂，进而将循环中的中性粒细胞募集至肿瘤组织，形成TANs。目前发现募集作用最强的趋化因子是IL-8/趋化因子8（chemokine 8，CXCL8），另外 CXCL1、CXCL2、CXCL5 及 CXCL6 等其他趋化因子对TANs 也有较强的趋化作用［13］。募集至肿瘤微环境的TANs 可进一步合成、分泌大量蛋白酶参与肿瘤微环境重塑，导致更多炎症细胞聚集。ZHOU 等［14］研究发现，TANs 可进一步招募巨噬细胞、T 淋巴细胞等共同参与促进肝肿瘤细胞的侵袭和转移。TANs的数量还与肝肿瘤大小、肿瘤组织内血管新生及肿瘤组织分期分化呈正相关。因此，抑制TANs 广泛募集至肿瘤微环境，减少肿瘤微环境TANs 的形成，可能在癌变的早期起到一定的预防作用［15］。鉴于趋化因子对TANs 募集的重要作用，改变肿瘤微环境中趋化因子的水平，破坏肿瘤微环境的稳定状态，可有效减少TANs 在肿瘤组织内的募集。有研究表明，采用IL-8 拮抗剂（ABXIL8）可有效降低肿瘤组织中TANs的浸润，使得黑色素瘤与肺癌等肿瘤细胞的增殖、转移能力明显减弱，肿瘤组织内的血管新生也得到明显抑制［16］。C-X-C趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine recep⁃tor 2，CXCR2）中和抗体或小分子抑制剂的使用也可显著抑制TANs 的聚集，从而抑制肿瘤生长［17］。另有研究报道，采用CXCR1小分子拮抗剂Reparixin可显著减少TANs 在肿瘤组织中的浸润并抑制肿瘤的发生发展［18］。趋化因子的产生和活性主要受相关通路的调节，如ras 癌基因上调CXC 趋化因子的表达，导致肿瘤发生部位大量TANs 聚集，因此抑制相关通路的激活也可达到减少TANs浸润的目的［19-20］。

2.2 阻断TANs 的促肿瘤效应 TANs 在肿瘤微环境的作用下释放多种促肿瘤因子进而促进肿瘤发展，这是目前普遍公认的TANs 促瘤机制。N2 型TANs可释放多种蛋白酶，促进肿瘤细胞的恶性增殖和转移。其中弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）主要参与肿瘤的恶性增殖过程；MMPs 主要调控肿瘤的血管新生及转移。阻断或减少这些蛋白酶的产生有望达到抑制肿瘤进展的目的。HOUGHTON等［21］在大鼠肺癌模型研究中发现，TANs分泌的大量NE 能够直接促进癌细胞增生，而减少NE 的分泌能够显著抑制肺癌细胞生长［22］。CARUSO等［23］研究发现，高水平的NE 可促进乳腺癌细胞增殖能力，而沉默小鼠NE 基因后，肿瘤生长速度明显减慢，肿瘤体积也显著减小。MMPs 可降解细胞基底膜，破坏组织学屏障，促进癌细胞的侵袭和转移。其中MMP-9被认为是癌细胞转移扩散过程中最重要的蛋白酶之一。高剂量的MMP-9 除了可以降解肿瘤细胞外基质，还可刺激血管新生，加速肿瘤扩散［24］。TANs可分泌大量MMP-9，是MMP-9的主要来源细胞。采用MMP 强效拮抗剂唑来膦酸抑制肿瘤微环境中MMP-9 的表达和作用，可有效减少肿瘤组织内的血管新生，进而抑制宫颈癌进展［25］。另有研究发现，通过安卓奎诺尔抑制MMP-9 基因表达及活性，可显著抑制乳腺癌细胞增殖、转移和侵袭［26］。此外，在肿瘤细胞及肿瘤微环境的影响下，TANs可促进前动力蛋白2（prokineticin 2，PROK2）表达，后者可通过促进内皮细胞的增殖加速血管生成。PROK2 抗体的使用可有效抑制肿瘤血管新生和肿瘤生长［27］。此外，通过特异性阻断重要信号通路的激活，抑制TANs 来源的促瘤物质产生，也可对肿瘤的形成、进展及转移进行抑制。LEE 等［28］进一步研究发现，安卓奎诺尔可能通过调控核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）/MMP-9信号通路抑制MMP-9的表达及活性，进而抑制肿瘤的进展。PENG 等［29］发现，将中性粒细胞和黑色素瘤细胞共培养后，中性粒细胞内NF-κB通路被异常激活；采用抑制剂阻断该通路后，肿瘤细胞的增殖能力受到明显抑制。另有研究发现，肿瘤细胞培养基上清能够快速激活中性粒细胞的 PI3K/Akt 通路［30-31］。该通路在 TANs 发挥促肿瘤效应方面起重要作用，阻断这些通路的激活可以减少TANs 趋化因子及MM-9 等多种酶类的分泌，达到抑制肿瘤进展的目的。

2.3 剔除肿瘤微环境中的TANs 尽管早期的研究主要聚焦在TANs 的抗肿瘤作用，但最近越来越多的研究却发现TANs 能够通过多种机制促进肿瘤的发生和发展。多数临床研究认为大量浸润的TANs是肿瘤患者预后不良的评估指标之一［32］。清除肿瘤组织中的TANs 浸润，抑制机体的炎症状态有望成为抑制肿瘤进展的有效途径。有研究发现，在氧化偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸酯钠（azoxymethane/dex⁃tran sodium sulfate，AOM/DSS）诱导的结肠炎相关结肠癌（colitis associated colorectal cancer，CAC）小鼠模型中，聚集在肿瘤组织中TANs 生成MMP-9 和NE的能力明显增强，导致肿瘤组织过度的血管再生和细胞增殖。采用中性粒细胞中和抗体耗竭小鼠体内的TANs 能显著减少肿瘤的数量和大小，并逆转肿瘤的发生［33］。此外，研究者还发现肿瘤组织中浸润的TANs 能够产生大量IL-1β，后者诱导肠上皮细胞和单核细胞释放IL-6 和IL-17，促进CAC 发展；将TANs 剔除后，CAC 的进展被显著抑制［34-35］。以上提示，清除机体的TANs，控制肿瘤微环境的快速形成，减少局部组织异常炎症反应，也是抑制肿瘤进展的一种有效途径。然而，中性粒细胞是体内最重要的先天性免疫细胞之一，目前的研究手段暂无法仅仅针对N2 型TANs 进行剔除。TANs 的剔除将从源头上消除所有中性粒细胞的生物学功能，包括中性粒细胞机体防御功能及N1 型TANs 抗肿瘤功能等；中性粒细胞的缺失，也容易导致机体的免疫力低下。因此，体内耗竭中性粒细胞疗法目前仅停留于动物模型实验。

2.4 增强TANs抗肿瘤能力 通过增加N1型TANs的数量和活性，增强TANs 抗肿瘤能力可能有助于肿瘤的治疗。ERUSLANOV 等［36］直接将 N1 型 TANs与肺癌细胞共培养一段时间后发现，与未加入N1型TANs的肺癌细胞组相比，共培养组中肿瘤细胞数目明显减少，表明增加的N1 型TANs 能够显著抑制肿瘤细胞的增殖能力。TANs 主要通过中性粒细胞的细胞毒作用发挥抗肿瘤特性。中性粒细胞含有大量的细胞毒介质，包括活性氧（reactive oxygen spe⁃cies，ROS）、过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）以及可溶性细胞杀伤介质，如 TNF-α、IL-1β 和干扰素（interferons，IFNs）等。这些细胞毒介质可诱导肿瘤细胞凋亡、死亡和溶解。有学者发现在肿瘤发展的早期阶段，TANs对肿瘤细胞表现出更强的细胞毒性作用，其可大量分泌一氧化氮（nitric oxide，NO）、H2O2、TNF-α及ROS等细胞毒介质杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的发生发展；而在肿瘤发展的后期阶段，TANs的这些功能被下调，其分泌的细胞毒介质水平明显下降，TANs 的促瘤表型占优势，导致肿瘤进展加速［37］。BLACHE等［38］在肿瘤组织内发现大量聚集的TANs 可产生大量ROS，同时伴随着肿瘤细胞的明显凋亡，提示TANs 产生的ROS 可诱导肿瘤细胞发生凋亡。因此，增强TANs 的N1 型能力，刺激N1型TANs 活化并产生大量细胞毒介质直接杀伤肿瘤细胞，可起到抑制肿瘤进展的作用。TAKESHIMAA等［39］发现，在肿瘤微环境中，放射诱导的中性粒细胞（RT-recruited tumor-associated neutrophils，RT-Ns）会产生更多的ROS 攻击肿瘤细胞，其诱导肿瘤细胞凋亡的能力也明显增强。另外，N1 型TANs 的抗肿瘤作用机制还包括抗体依赖的细胞毒性作用。抗体通过TANs 表面的Fc 受体（Fc receptor，FcR）识别肿瘤细胞抗原，诱导中性粒细胞释放细胞毒介质，发挥细胞毒性作用，从而杀伤肿瘤细胞［40］。因此，可以通过抗肿瘤单克隆抗体（mAbs）的应用，增强TANs 的ADCC 潜能。已有的研究发现，抗肿瘤融合抗体可进一步增强TANs的ADCC 作用［41］。例如，在中性粒细胞对表达表皮生长因子受体1（human epi⁃dermal growth factor receptor-1，HER1）和 HER2 肿瘤细胞的杀伤作用研究中，研究者发现相对于抗体的单独使用，IgG 和IgA 融合抗体使中性粒细胞具有更强的细胞毒作用，能够更有效地杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的进展。

2.5 诱导极化中性粒细胞 除了增强N1 型TANs的抗肿瘤活性，诱导N2 型TANs 向N1 型转化，使所有TANs 均发挥抗肿瘤作用，有望成为靶向TANs 治疗肿瘤的最佳策略。鉴于TANs 的表型转换主要受肿瘤微环境内因子水平的影响，改变肿瘤微环境中的因子水平可能促进N2 型TANs 向N1 型转化。SUN 等［42］研究发现，N2 型 TANs 在体外经 IFN-γ 和TNF-α 预激后，其能够恢复为具杀瘤活性的N1 型，主要体现在TANs 的细胞毒作用和活化其他免疫细胞的能力显著增强。IFN-β 也能够诱导N2 型TANs向 N1 型转化。ANDZINSKI 等［43］发现抑制 IFN-β 通路后黑色素瘤和纤维肉瘤组织内N2型TANs浸润数明显增多，肿瘤细胞生长迅速，肿瘤组织内血管新生明显；而用 IFN-β 处理 TANs 后，小鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及MMP-9 的表达水平明显下降，小鼠的成瘤能力被显著抑制。另有研究表明，肿瘤中的TGF-β 可促进N1型TANs 向促瘤型极化，而阻断TGF-β 后能使TANs发挥抑瘤作用。在间皮瘤小鼠模型中，将小鼠体内的TGF-β 下调后，肿瘤组织内募集的TANs 对肿瘤细胞有较强的细胞毒性，并且表达较高水平的炎症因子；另外CD8+T细胞也被显著激活，从而抑制肿瘤的生长和转移［44］。小鼠肺癌模型研究进一步证实：当 TGF-β 通路激活时，中性粒细胞获取 N2 表型，而阻断TGF-β通路可诱导TANs获取N1表型［44］。课题组在前期研究中也发现，采用TGF-β 抑制剂阻断结直肠肿瘤中的TGF-β信号通路后，TANs的细胞毒作用明显增强，其分泌的趋化因子水平下降，导致肿瘤细胞凋亡明显，肿瘤细胞迁移能力减弱。在小鼠模型试验中也观察到TGF-β 信号通路的阻断能显著抑制肿瘤的进展［45］。值得一提的是，与同时进行TANs剔除的小鼠相比，仅仅抑制TGF-β信号通路的小鼠表现出更显著的抑瘤效果。以上说明抑制TGF-β 通路可诱导 N2 型 TANs 向 N1 型转化，抑制肿瘤的进展。此外，脂质A能够诱导TANs发挥抗肿瘤作用，与化疗药物奥沙利铂联用时可以更好地发挥抗肿瘤效应［46］。SHRESTHA 等［47］最近发现，血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂的使用能够诱导TANs 发挥抗肿瘤效应，从而抑制肿瘤生长。另有研究发现IL-35 能够刺激机体产生大量IL-6和粒细胞集落刺激因子，后两者可诱导TANs向N2极化并促进肿瘤生长［48］。因此，通过控制肿瘤微环境中IL-35 的表达，可在一定程度上抑制TANs向N2 转化，达到控制肿瘤发生发展的目的。可见，诱导TANs 型别向抗肿瘤效应转化，可为肿瘤的治疗提供一种新的策略。

3 结语

TANs 在肿瘤中的作用目前已成为肿瘤学研究领域的热点，如何利用好TANs 的两面性将成为未来的一项严峻挑战。目前靶向治疗的方式多样，但仍未取得显著的临床结果。如虽然大量体内外研究证实阻断MMP-9 在治疗肿瘤中的良好效果，但Ⅲ期临床试验结果显示晚期癌症患者未能够从应用MMP-9 抑制剂中获益［26］。另外，目前的研究大多仅限于细胞学实验及动物体内试验，尚缺乏对肿瘤患者进行临床综合研究。如高剂量ROS 的致癌性，TANs耗竭导致机体的免疫力低下等，都是从实验研究跨度到临床应用需要面对的重要问题。要利用TANs 两面性进行肿瘤治疗，必须充分明确TANs 在肿瘤微环境中的生物学活性和作用，更为全面地探索TANs 促瘤或抑瘤作用的途径及机制。令人欣慰的是，一项关于黑色素瘤的临床治疗研究表明，Ⅰ型IFN 能够使黑色素瘤内的TANs 类型从N2 型向N1 型转化，进而抑制肿瘤的进展，这为其他临床治疗研究提供基础，也为后续的医学转化带来了希望，从而使得基础研究真正服务临床［43］。