组蛋白去乙酰化酶4在缺血性卒中失调的研究进展*

刘 丹，杨锡彤 综述，王光明审校

(大理大学第一附属医院基因检测中心，云南大理 671000)

卒中是我国人口常见死亡原因之一，也是全球人口第二大死亡原因，具有高发病率、高病死率、高致残率、高复发率及并发症多等特征，其与冠心病和癌症并列为威胁人类健康的三大疾病，通常被分为缺血性卒中和出血性卒中[1-2]。缺血性卒中是各种原因导致脑部血液供应障碍，局部脑组织缺血、缺氧性坏死而出现相应神经功能损伤的一类临床综合征，其发病率可占所有卒中的70%～80%。研究发现，约1/3的缺血性卒中患者会在发病后立即死亡，另有10%～15%的患者在1年内死亡，其余幸存的患者有近80%的可能会伴有各种神经功能缺陷[3]。近年来由于医学的进步，卒中患者的病死率逐步降低[4]。但是，在几十年的研究进程中，临床对于缺血性卒中的治疗仍停留在溶栓和症状控制方面。因此，对缺血性卒中的发病机制及治理干预等进行深入研究显得尤为重要。卒中的病理生理过程受多种因素影响，其中炎症和遗传在卒中的发病过程中起着重要作用。本文就表观遗传学在缺血性卒中的治疗进展作一综述。

1 组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)的生物学特征

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一类在真核生物(包括酵母、哺乳动物和植物)中广泛存在的超基因家族。HDACs是一大类酶，通过催化作用从组蛋白尾赖氨酸残基中去除乙酰基，调节组蛋白乙酰化水平，基于功能和DNA序列的相似性被分为4个不同的亚类(Ⅰ～Ⅳ)[5]。Ⅰ类HDAC家族由HDAC1、2、3和8组成；Ⅱa类HDAC由HDAC4、5、7和9组成，HDAC6和HDAC10构成Ⅱb类HDAC家族；Ⅲ类即沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，SIRT2)；HDAC11是唯一的Ⅳ类HDAC。HDAC4在大脑中高度表达，神经元活动依赖于HDAC4的核质穿梭。HDAC4是一种大蛋白，具有延伸的N端调节结构域和C端尾[6]。Ⅱa类HDAC的核-细胞质穿梭是一种依赖突触活性和核钙的机制，对海马神经元信号调控基因表达的表观遗传调控非常重要。尤其是HDAC4在突触结构和可塑性重要基因的调控作用中有着密切的联系[7]。在钙离子流入的反应中HDAC4被激酶磷酸化，如钙离子/钙调蛋白依赖性激酶Ⅳ(CaMKⅣ)，其是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可磷酸化HDAC4，HDAC4的磷酸化使其能够随后与14-3-3蛋白结合，从而导致HDAC4的核输出[8]。HDAC4还可能通过促进血管生成、神经再生来抑制神经元死亡，从而在卒中的发生、发展过程中起着重要作用。

越来越多的证据表明，表观遗传修饰在应激神经元的存活/死亡中起着关键作用[9]。表观遗传学是分子生物学的一个分支，研究能够在不改变DNA序列的情况下改变基因表达的修饰，可以调节生物体内发生的不同生理过程，表观遗传调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等，近年来发现表观遗传与缺血性卒中在内的心血管疾病的发病机制有关，重要的是，由于表观遗传修饰是可逆的过程，因此它可以用来探究新的治疗方法[10-11]。在表观遗传的调控中组蛋白乙酰化是最常见的过程，组蛋白乙酰化在正常细胞过程中起着重要的调控作用，受HDACs和组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferases，HATs)的调控[12]。HATs和HDACs是一对拮抗酶，通过乙酰化和去乙酰化组蛋白调节基因的表达。HATs在组蛋白的“尾巴”上乙酰化赖氨酸残基，而HDACs则去除乙酰基。HDACs是一种去除组蛋白和非组蛋白乙酰基的酶[13]，通过去除乙酰化组蛋白尾中的特定赖氨酸残基，HDACs使染色质凝聚和基因抑制[14]。

2 缺血性卒中发生及卒中后恢复的机制

缺血性卒中由脑动脉闭塞引起，卒中发生的几分钟内血液供应被迅速抑制。缺氧和葡萄糖不足导致三磷酸腺苷(ATP)耗竭和神经组织梗死[15]。最终的梗死面积和神经结局取决于多种因素，如缺血的持续时间和严重程度、侧支系统的存在和足够的全身血压、梗死的病因和定位，同时也取决于患者的年龄、性别、遗传背景及相应多药治疗的并发症等因素[16]。因此，卒中是一种复杂且具有异质性的疾病。卒中后的血管生成、神经发生等都与缺血事件后大脑的恢复有关。

2.1 细胞损伤

缺血性卒中由大脑动脉阻塞引起，其损伤过程从梗死核心向周围组织扩散。卒中发生后，血液急剧减少到15%以下，形成缺血区的中心区域，而缺血区的周围区域(缺血半影区)血供较中心区高。卒中发生后几分钟内就会出现坏死，因此核心区域无法被挽救，但是半影区细胞通过适当的干预可以被挽救。梗死周围区域(危险区域/缺血半暗区)的组织损伤发展较慢，持续数小时，这一治疗窗口为细胞保护提供了时间[17]。通过阻断有害的通路，可减少半影区细胞凋亡和损伤，改善卒中治疗潜力。

2.2 血管生成

血管生成在人体生理过程中起着核心作用，从生殖和胎儿发育到伤口愈合和组织修复/再生。血管生成在内源性再生机制中具有良好的临床意义[18]。梗死周围微血管密度增加与缺血性卒中患者更长的生存时间有关，并可以改善缺血性动物模型的预后。表明增强血管生成可能是促进缺血性卒中后功能恢复的策略之一。血管和神经元细胞通过各种介质相互交流，并作为一个单位参与脑缺血的病理生理过程[19]。缺血性卒中后血管生成有利于中枢神经系统缺血半影区脑血流的恢复，对缺血性卒中患者的长期恢复有良好的影响。如果在短时间内缺血半影带血流恢复，则该区域脑组织的损伤是可逆的，神经细胞有可能存活并恢复功能。

2.3 神经再生

神经发生有助于卒中后的恢复[20]。血管生成和神经生成是相互关联的神经修复机制，卒中所致损伤可诱导梗死区半暗带的神经发生。卒中发生后脑血流突然减少导致缺氧，从而引发兴奋性毒性、氧化应激和神经炎症。有证据显示，脑缺血后中枢神经系统存在内源性神经发生过程的增强，即静止的神经干细胞(neural stem cells，NSC)被激活，之后分化增殖成神经前体细胞和神经母细胞，并迁移至损伤脑区如纹状体、大脑皮质及原位海马分子层，通过在损伤区产生新生神经元来修复受损脑组织。这种成体大脑的自我修复机制，对脑缺血的恢复具有实质性影响。缺血损伤可在一定程度上激活内源性NSC。缺血发生后，侧脑室脑室下区和齿状回颗粒下区存在的神经前体细胞增殖并向病变区迁移，促进脑修复[21-23]。增强由缺血驱动的内源性神经发生，促进新生神经元的存活，是具有前景的卒中治疗干预措施。此外，以干细胞为基础的治疗有助于神经再生和患者的神经恢复。然而，干细胞在逆转症状方面的作用模式尚不清楚，在建立卒中干细胞治疗之前，尚需明确给药的干细胞类型、干细胞数量、用药时间、是否需要剂量增强剂、给药途径等临床参数。尽管干细胞治疗仍处于发展阶段，但对卒中患者的神经康复具有巨大的潜力[24]。

3 HDAC4在缺血性卒中的作用机制

3.1 HDAC4在神经元中的作用

卒中会导致脑梗死周围皮层神经元中HDAC4的核穿梭，表明核仁HDAC4的增加与神经元重构密切相关，但与神经元细胞凋亡无关。HDAC4在促进缺血性损伤后神经元恢复中具有重要作用[25]。在缺血性卒中模型小鼠/ats和氧-葡萄糖剥夺(OGD)处理的神经元中观察到HDAC4核穿梭增加，而钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)的过度表达降低了核HDAC4水平[26]。实验表明，CaMKIV的基因缺失能够增加卒中后小鼠HDAC4的细胞核积累，CaMKIV的过表达降低了缺血后细胞核HDAC4的水平。此外，当HDAC4被抑制时，CaMKIV过表达提供的神经保护作用在 OGD 模型中缺失。以上y研究提示，CaMKIV 是缺血中 HDAC4 的上游调节剂[27]。HDAC4易位是卒中后神经元死亡的关键调节步骤，在缺血条件下，CaMKⅣ控制神经元中细胞核和细胞质之间的HDAC4平衡。

3.2 促进血管再生和神经发生

越来越多的证据表明，缺血性卒中后的血管生成对于卒中预后有极大的影响。血管生成受多种生长因子共同调控，是多种相关基因多步骤协同作用的共同结果。缺氧诱导因子-l(hypoxia induciblefactor-1,HIF-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是研究较早的广泛应用于缺血性疾病研究的调控因子[28]。研究证明，HDAC4存在多个磷酸化位点,卒中后HDAC4的磷酸化明显上调，能够从细胞核转移至细胞质，激活下游与血管相关基因的表达，而抑制HDAC4磷酸化可显著降低缺血脑组织的血管生成反应。脑缺血后4～7 d，缺血核心和周围边缘血管新生，缺血皮质区HIF-1α和VEGFa表达明显上调，同时伴随HDAC4蛋白磷酸化水平的明显变化[19，28]。表明HDAC4的磷酸化对脑缺血后血管生成至关重要，HDAC4对血管生成的调节作用可能是通过调节HIF-VEGF信号来实现的，提示在卒中有新的治疗靶点[6]。HDAC4可能通过调节多个分子的表达和功能促进神经发生，如微RNA-9(miRNA-9)，miRNA-9是一种神经元特异性miRNA，是神经发生的重要调控因子，只有3个基因组位点中的一个能够编码miRNA-9，而其中Mef2具有亲神经作用。在四个Mef2旁系同源物中，有研究发现仅Mef2在神经发生过程中受到调控，在分化过程中，Mef2C 通过结合上游调节位点来激活miR-9-2(miR-9-2是分化神经元前体中主要受调控的 miR-9 位点)从而导致 miR-9 表达增加，反过来，增加的 miR-9 水平有助于减弱Mef2的抑制剂HDAC4，这样看来miR-9对 HDAC4的抑制强化了正反馈方案，该方案增强了神经前体细胞的神经发生功能，促进神经再生[29]。此外，研究发现逆转miR-9水平可以抑制中脑动脉栓塞(MCAO)模型和糖氧剥夺(OGD)离体脑缺血模型中的神经元的凋亡[30]。通过上调miRNA-9，有助于缺血性卒中后神经元的存活和再生。而HDAC4失活在体外能积极调节miRNA-9的表达，减轻缺血损伤[31]。一项研究表明，HDAC4是丝裂原活化蛋白激酶7(MAP Kinase Kinase 7，MKK7)转录和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)激活所必需的，MKK7是JNK上游激酶，HDAC4特异性抑制剂LMK235剂量依赖性地抑制MKK7转录和JNK/c-Jun活性，通过LMK235抑制HDAC4显著挽救了钾剥夺诱导的小脑颗粒神经元(CGN)细胞凋亡,与MKK7转录、JNK/c-Jun活性和神经元凋亡的明显减少相关,HDAC4在神经元凋亡中起着重要作用[32]。

4 卒中的治疗现状及HDAC4在卒中治疗中的应用

缺血性卒中是致死和致残的主要原因之一，缺血性损伤和细胞凋亡的演变在几分钟、几小时甚至几天内持续，促进血管再生和神经发生成为治疗缺血性卒中的候选方法。目前普遍认为实现早期缺血部位血流再灌注为救治该类患者的有效手段，但存在明显的局限性：(1)可实现缺血部位血流再灌，恢复缺血部位功能，缓解病情；(2)易引发脑缺血再灌注损伤(ischemia and reperfusion injury, I/RI),使病情进一步加重。

HDACs是卒中治疗的潜在靶点[5]。已被证明在动物模型中，一般的HDACs抑制剂(HDACi)可以预防脑缺血。有报道证实，组蛋白去乙酰化酶超家族抑制剂可诱导细胞周期阻滞、触发细胞死亡和减少血管生成，是一种很有前景的靶向表观遗传调控基因表达的抗癌药物[33]。其中有几种HDACi已被美国食品与药品监督管理局(FDA)批准用于癌症的临床应用[34]。HDACs被认为具有神经毒性和神经保护作用，并且部分依赖于其亚细胞分布，HDACi在治疗包括癫痫在内的各种神经系统疾病方面也有着悠久的历史[35]。HDACi可保护卒中后的神经细胞。在光血栓梗死(PTI)后期小鼠的缺血核心周围组织中感觉运动皮层和对侧半球相应区域内，观察到皮质神经元HDAC4的减少和核移位的增加[36]。这也将会成为卒中后治疗的新的靶点。目前临床还没有关于HDACi的药物应用于缺血性卒中，而且有关HDAC4用于卒中治疗的效果研究也仅限于大鼠、小鼠的卒中模型，还要进一步进行临床前研究。同时，也需要评估HDAC4 用于卒中治疗的效果和安全性。

5 小 结

HDAC4在卒中的发生、发展过程中具有重要作用，可能通过促进血管生成、神经再生来抑制神经元死亡。通过调节HDAC4可以促进HIF-VEGF信号下游靶基因的表达，上调miRNA-9促进血管生成，以及神经发生来干预神经元死亡。虽然大多数的研究都是在动物模型中完成，但是许多调节HDAC4水平的方法可应用到临床中，如上调miRNA9的表达水平来抑制HDAC4。因此，调节HDAC4表达可能转化为临床用于治疗缺血性卒中的有效方法，但仍然需要大量的临床研究评估其疗效和安全性。