再生障碍性贫血相关信号通路的研究进展*

张小敏 ， 朱玲玲 ， 肖 扬 ，3△

（1广州中医药大学金沙洲医院，广东广州510168；2南方医科大学中医药学院，广东广州510515；3广州医科大学附属第二医院，广东广州510260）

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一类由多种原因引起的全血细胞减少和骨髓增生减低的骨髓衰竭性疾病，临床主要表现为贫血、出血及感染等，按疾病严重程度可分为重型再生障碍性贫血（severe aplastic anemia，SAA）和非重型再生障碍性贫血（non-severe aplastic anemia，NSAA）。其中，对于年龄≤35 岁的SAA 患者，首选人类白细胞抗原（human lymphocyte antigen，HLA）相合的同胞供者异基因造血干细胞移植；35～50 岁的 SAA 患者可优选 HLA 相合的同胞供者异基因造血干细胞移植，次选免疫抑制治疗（immunosuppressive therapy，IST）；而对于年龄＞50 岁的 SAA 患者，或 NSAA 患者，推荐 IST。目前公认有效的IST 方案为抗胸腺细胞球蛋白（anti-human thymocyte globulin，ATG）联合环孢菌素A（cyclosporin A，CsA）治疗。作为AA 治疗的重要手段之一，IST的反应率仅约70%，仍有30%患者对IST无反应，并且IST 后复发率较高。还有部分AA 患者在疾病初期及治疗过程中可能出现细胞遗传学异常，如-7/7q-、+8和+6等，并且这些遗传学异常与AA 疗效相关。伴-7/7q-及+6 染色体结构异常的AA 患者对IST反应欠佳，因而造血干细胞移植为其合适的治疗选择；而对于伴+8 染色体结构异常的 AA 患者，IST 疗效相对较好。因此，深入探讨AA 的病理机制及治疗靶点对改善AA疗效具有重要意义。

细胞信号转导是引发靶细胞产生生物学功能的重要过程，而细胞信号转导异常可导致靶细胞功能异常，进而参与疾病的发生及进展。由于AA 发病机制较复杂，涉及免疫功能异常、造血干细胞缺陷和骨髓造血微环境异常等，因此可能存在多条信号通路共同参与AA 发生及发展过程。目前研究报道与AA相关的信号通路主要包括：（1）免疫异常：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Notch1（Notch homolog protein 1）、基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）/C-XC 趋化因子受体 4［chemokine（C-X-C-motif）receptor 4，CXCR4］及含T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白3（T-cell immunoglobulin and mucin domain-contraining protein-3，Tim-3）信号通路；（2）造血干细胞凋亡及缺陷：Fas/Fas 配体（Fas ligand，FasL）及血小板生成素（thrombopoietin，TPO）/TPO 受体 c-MPL（cellular myeloproliferative leukemia）信号通路；（3）造血微环境异常：过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/Notch1 信号通路。本文就AA 相关信号通路进行综述，以期为AA发病机制及治疗研究带来新的思路和启发。

1 参与免疫异常的信号通路

1.1 mTOR 信号参与调节T 细胞增殖及树突状细胞（dendritic cells，DC）分化 mTOR 是雷帕霉素（rapamycin）作用的唯一靶蛋白，通过感知细胞外生长因子、葡萄糖、氨基酸等多种刺激，参与T 细胞活化、增殖、分化及耗竭等过程［1］。既往大量研究表明，T 淋巴细胞的异常活化及亚群比例失常与AA 发病密切相关。在AA患者中CD8+T细胞比例明显增加，异常活化的CD8+T细胞通过直接接触及分泌造血负调控因子介导造血干细胞的破坏。随着AA 免疫病理机制研究的不断深入，还存在多种T 细胞亚群在AA 发病中起作用。在AA 患者中1 型辅助性T 细胞（Th1细胞）转录因子T-bet表达上调，介导Th1细胞功能亢进并进一步辅助CD8+T 细胞发挥细胞毒作用；并且在AA 患者中具有免疫抑制作用的调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）数量减少，存在辅助性T 细胞17（Th17）/Treg 比例失衡。张晓东等［2］发现，在AA小鼠骨髓中mTOR 和S6K1 的表达较正常对照组明显升高，而且mTOR 的表达与外周血细胞水平呈负相关，提示mTOR信号可能参与AA的发生。Liu等［3］发现，采用 mTOR 抑制剂 rapamycin 抑制 mTOR 及其下游信号分子p-S6 和p-AKT 表达后，免疫介导的AA小鼠骨髓中CD8+T细胞比例降低及骨髓衰竭程度减轻，进一步通过体外细胞实验证实rapamycin 可抑制T 细胞增殖，提示mTOR 信号参与调控T 细胞增殖。此外，mTOR 还可以调节T 细胞的分化，在幼稚CD4+T 细胞向Treg 分化过程中发挥负调控作用，但在Th1和Th17 细胞中其活性增加并参与Th1 和Th17 细胞的分化及成熟［4］。上述研究表明在AA中mTOR信号参与T 细胞介导的免疫异常，可作为AA 治疗靶点之一。

DC 作为最主要的专职抗原提呈细胞（antigenpresenting cells，APC），能提供 T 细胞活化的 3 种信号［第一信号为主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-抗原肽复合物；第二信号为共刺激信号B7 分子；第三信号为细胞因子，如干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等］，来启动和调控T细胞免疫应答。近年来有研究表明，DC 数量及功能异常也参与AA 免疫异常的发病机制。Liu 等［5］和 Guan等［6］证实，SAA 中异常活化的髓样 DC（myeloid DC，mDC）数量较正常人明显增加，高表达共刺激分子CD86，提示异常活化的DC 可能参与SAA 免疫亢进状态。DC 通过摄取、加工和提呈抗原，自身逐渐趋向成熟，提呈抗原和提供共刺激信号的能力增强，并且诱导幼稚T 细胞分化为Th1 细胞和细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTL）。在天然免疫中，mTOR复合物1（mTOR complex 1，mTORC1）参与调节 DC 分化和抗原呈递功能［7］；采用 mTOR 抑制剂rapamycin 可减少mDC 的数量及共刺激分子的表达，诱导致耐受DC，从而导致抗原提呈及激活T 细胞的能力降低［8］。以上研究提示mTOR 信号可能通过调控T 细胞介导的特异性免疫应答及DC 介导的天然免疫应答等双重免疫应答途径诱导AA 免疫异常，并且mTOR 抑制剂可能具有缓解AA 免疫异常的潜在临床应用价值［9］。

1.2 Notch1信号与T细胞分化 Notch1信号通路是一种由受体、配体和胞内效应分子组成的高度保守的信号通路。当Notch1受体与相邻细胞的同源配体结合时，产生具有信号传导能力的活性成分Notch细胞内结构域（Notch intracellular domain，NICD），可移位至细胞核参与调节基因的转录，进而调节T 细胞分化、发育及功能［10］。Roderick 等［11］和 Minter［12］发现，在AA 模型小鼠中Notch1 和Th1 细胞特异性转录因子T-bet 表达增加，抑制Notch1 信号后Th1 细胞极化被抑制，其转录因子T-bet 表达降低，并且模型小鼠骨髓衰竭程度减轻，表明Notch1 信号可通过调控T-bet 的表达来调节 Th1 细胞分化。Song 等［13］和 Li等［14］通过临床及动物实验研究发现，回输的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可通过Notch信号通路调节AA患者及免疫介导的AA模型小鼠中T 细胞亚群的分化，进而调节 Th1/Th2、Th17/Treg 平衡及降低造血负调控因子 TNF-α 和 IFN-γ 水平。以上研究提示Notch1 信号在调节AA 患者T 细胞亚群分化中发挥重要作用。

1.3 SDF-1α/CXCR4 信号与T 细胞骨髓浸润 SDF-1 是 C-X-C 趋化因子家族成员之一，CXCR4 是 SDF-1的主要受体之一。SDF-1 和CXCR4 表达于多种组织和细胞，当它们形成配体受体复合物后具有调控细胞迁移、黏附和归巢的作用。在炎症损伤时，损伤处SDF-1 表达水平增高，与外周组织中的SDF-1 形成浓度差，以此趋化表达CXCR4 的细胞顺应浓度梯度迁移至靶组织。Arieta Kuksin 等［15］和 Chaix 等［16］发现CXCR4 能促进T 细胞向骨髓归巢，当抑制CXCR4 表达时 AA 小鼠骨髓中 T 细胞浸润显著减少。Niu 等［17］报道，SAA 患者外周血中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞高表达CXCR4，并且CXCR4+CD8+T 细胞百分比显著高于CXCR4+CD4+T 细胞。以上研究提示，SDF-1α/CXCR4 信号可能参与介导外周T 细胞向骨髓迁移、浸润，尤其是促进CD8+T 细胞向骨髓浸润，参与免疫介导的造血干细胞破环。

1.4 Tim-3低表达与自然杀伤（natural killer，NK）细胞和Th1细胞异常 Tim-3是Tim基因家族中的一个重要成员，是机体中重要的负性共刺激分子，在Th1细胞、DC、NK 细胞等细胞中均有表达。在SAA 患者中存在NK细胞数量和功能的异常［18］。Zhang等［19］发现，与正常对照组相比，SAA 患者NK 细胞及CD56dimNK 亚群上Tim-3 表达降低，并且与SAA 的全血细胞减少程度具有相关性，在免疫抑制治疗后NK 细胞中Tim-3水平升高，提示NK细胞中Tim-3异常表达可能参与 AA 发病。此外，Tim-3 与其配体 galectin-9 结合可特异性诱导Th1 细胞凋亡、负向调控Th1 反应，而Shan 等［20］报道 SAA 患者 CD4+T 细胞上 Tim-3 表达明显降低，提示Tim-3 低表达可能介导Th1 细胞逃逸galectin-9诱导的细胞凋亡。

2 介导造血干细胞凋亡及缺陷的相关通路

2.1 Fas/FasL 与造血干细胞凋亡 Fas（又称Apo-1或CD95）属于肿瘤坏死因子受体超家族，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，在活化的淋巴细胞中高表达；FasL 是Fas 的天然配体，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表达于活化的T 细胞、NK 细胞及免疫豁免区的细胞。Zhu 等［21］发现，在 AA 患者中 T 细胞与造血干细胞的相互作用增强，诱导凋亡的相互作用分子对Fas/FasL普遍存在AA 患者骨髓细胞中。在AA 患者中FasL主要表达在活化的CD8+T细胞表面［22］，而Fas表达于CD34+、CD33+和CD14+造血干细胞。目前自身反应性T 淋巴细胞介导的造血干细胞损伤被认为是AA最主要的发病机制，其中CD8+T 细胞主要参与了骨髓造血干细胞的破坏，并且CD8+T 细胞可通过多种方式杀伤造血干细胞。CD8+T细胞表面的FasL识别造血干细胞膜上的Fas蛋白后，可形成凋亡诱导复合物——Fas 相关死亡结构域（Fas-associated death domain，FADD），启动造血干细胞内凋亡信号，激活caspase 级联反应，从而介导造血干细胞凋亡。Rehman 等［23］通过基因分型发现在 AA 患者Fas和FasL基因中存在多个单核苷酸突变，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），可介导异常的细胞凋亡。并且CD8+T细胞与造血干细胞识别后，CD8+T 细胞还能释放穿孔素，在靶细胞膜上形成活性孔道，致使造血干细胞内渗透压改变，与颗粒酶协同作用而诱导造血干细胞崩解、凋亡［24］。此外，AA患者骨髓中造血负调控因子IFN-γ和TNF-α的增加，可促进造血干细胞上MHC 分子的表达，增强CD8+T 细胞对造血干细胞的识别，并且进一步上调造血干细胞表面的Fas蛋白表达，促进诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）/一氧化氮（nitric oxide，NO）信号激活，诱导更多的造血干细胞凋亡［25-26］。还有研究发现，Fas 受体激动剂可促进造血干细胞中iNOS表达增加，而阻断iNOS信号后造血干细胞凋亡减少，提示iNOS 蛋白可能参与Fas/FasL介导的造血干细胞凋亡［27］。因此，在AA患者中Fas/FasL 信号通路是介导造血干细胞凋亡的重要途径之一。

2.2 TPO/c-MPL 与造血干细胞缺陷 TPO 主要由肝脏、肾脏及骨髓基质细胞产生，而c-MPL 表达于造血干/祖细胞和不同成熟阶段巨核细胞。TPO与其受体c-MPL 相互作用可促进巨核细胞增殖和血小板生成，并且能调控造血干细胞存活和增殖［28-29］。在AA中存在造血干细胞缺陷，目前TPO 受体激动剂艾曲泊帕（eltrombopag）已批准用于初始免疫抑制治疗反应不足AA 患者的单药治疗，其与造血干/祖细胞膜受体c-MPL跨膜结构域结合后可促进造血干/祖细胞增殖分化，扩增体内残存造血干细胞，使难治性AA患者三系细胞增加［30-32］。Walne 等［33］通过外显子测序发现在部分AA 患者中存在MPL 突变。以上研究提示AA 造血干细胞缺陷可能与TPO/c-MPL 信号表达异常有关。此外，eltrombopag 还能诱导Treg 生成、减轻IFN-γ 对AA 患者造血干细胞的抑制；并且eltrombopag是一种理想的铁螯合剂，可动员细胞内铁，降低AA患者体内铁负荷［34］。

3 参与造血微环境异常相关的信号通路

3.1 PPARγ 与间充质干细胞成脂分化 PPARγ 是调节脂肪酸形成的关键的转录因子，表达于脂肪和心血管等多种组织中，也表达于活化的T、B 淋巴细胞等，参与调节炎症反应过程。骨髓MSCs（bone marrow MSCs，BMMSCs）是一类具有自我更新、支持造血、免疫调节和旁分泌功能的干细胞，是骨髓微环境的关键组成部分。然而在AA 患者中BMMSCs 造血支持和免疫调节功能减弱，更易于向成脂细胞分化［35-37］。Zhang 等［38］发现，AA 患者 BMMSCs 中存在miR-199a-5p 高表达，通过慢病毒转染shPPARγ，发现PPARγ 可通过调节miR-199a-5p 表达来参与BMMSCs 成脂分化。在AA 模型小鼠中也发现BMMSCs 成脂分化能力增强，采用PPARγ 抑制剂BADGE 治疗后，骨髓中脂肪细胞明显减少，造血细胞显著增加，并且T 细胞增殖及活化受抑［39］，提示在AA 中 PPARγ 信号参与 BMMSCs 成脂分化及 T 淋巴细胞异常活化。

3.2 MAPK/ERK 抑制与骨髓增生减低 MAPK 是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，可被诸多细胞外刺激信号激活，如炎症因子和细菌复合物等，参与细胞的生长、增殖、分化及凋亡等。Wang 等［40］报道在 AA 患者骨髓单核细胞中 ERK1/2及磷酸化ERK1/2 的表达明显低于正常对照组；张爱萍等［41］发现，AA 模型小鼠骨髓组织及细胞中丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK1/2）、p-MEK1/2、ERK1/2 和 p-ERK1/2 蛋白水平较正常对照组明显降低，给予人参提取物的有效成分人参二醇组皂苷治疗后MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2 和 p-ERK1/2 蛋白水平增加，并且 AA 小鼠骨髓造血组织增加，三系细胞明显增生；Chan等［42］通过动物实验发现在缺乏ERK1的情况下，小鼠骨髓造血微环境存在缺陷，甚至出现骨髓衰竭。上述实验结果提示AA 骨髓增生减低可能与骨髓微环境中MAPK/ERK蛋白低表达有关。

3.3 VEGF/Notch1 信号低表达参与骨髓微环境异常 VEGF 及下游信号分子Notch1 是调节血管生成的关键信号［43］，在AA 患者中骨髓微血管生成减少，VEGF/Notch1表达显著降低，且两者存在相关性。邓姝等［44］发现，与健康对照组相比，AA 患者 BMMSCS中 VEGF、VEGFR 和 Notch1 的表达明显降低；而激活VEGF 信号可促进BMMSCs 增殖，改善AA 骨髓微环境，提示VEGF/Notch1 信号参与AA 骨髓造血微环境缺陷，VEGF/Notch1 信号通路可能是改善AA 骨髓微环境的潜在治疗途径之一。

4 总结与展望

综上所述，AA 是一种由多种原因引起的骨髓造血衰竭综合征，其发病机制较复杂且尚不完全清楚，主要涉及免疫异常、造血干细胞缺陷及造血微环境异常等，因此可能存在多种细胞、多条信号通路共同参与其发生发展等过程。随着免疫相关发病机制的研究进展，以及鉴于免疫抑制治疗的有效性，近年来AA 被认为是一种自身免疫性疾病，但是尚未找到特异性自身抗原［7］。目前对AA 的发病机制研究主要集中于T 细胞数量、功能及亚群比例异常，其他免疫细胞（如DC、NK 细胞等）数量及功能异常，还有细胞因子分泌异常等［45］。然而，骨髓微环境中成骨细胞、基质细胞、脂肪细胞等对AA 的影响尚不完全明确，需要进一步探索。部分AA 患者由于输血依赖容易出现继发性铁过载，诱导活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生和骨髓慢性氧化应激，导致骨髓微环境损伤［46-47］。对AA 发病机制及相关信号通路的深入探索，将进一步为AA 的临床治疗提供新的靶点和理论依据。