去泛素化酶OTULIN研究进展①

胥虹贝 罗 勇 （重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆400016）

线性泛素化修饰主要由泛素蛋白N末端的甲硫氨酸Met1 的氨基与另一泛素分子C 末端甘氨酸的羧基共价结合而成——甲硫氨酸1-泛素链（Met1-Ub）［1］。研究表明，由Sharpin、HOIL-1L和HOIP构成的线性泛素链组装复合体（linear ubiquitin chain as⁃sembly complex，LUBAC）可对NF-κB 通路中的重要组分NEMO 及NOD2 受体信号通路中的受体相互作用蛋白激酶 2（receptor interacting protein kinase 2，RIPK2）进行线性泛素链组装［2-3］。OTULIN（OTU domain DUB with Linear linkage specificity）作为一种重要的去泛素化酶，可通过S1'泛素结合位点特异性结合Met1-Ub，去除底物蛋白Met1-Ub，在OTULIN相关自身炎症反应综合征（OTULIN-related autoin⁃flammatory syndrome，ORAS）、细胞死亡、血管再生、神经炎症等病理生理过程中发挥重要作用。本文就OTULIN 结构、调节机制及生物学特性的研究现状进行概述。

1 OTULIN结构及调节机制

1.1 OTULIN 与Met1-Ub 人类OTULIN 基因位于染色体5p15.2 区，通过转录翻译合成含有352 个氨基酸的OTULIN 蛋白［4-5］。晶体结构分析表明，Asn341、His339 和 Cys129 构成 OTULIN 蛋白三级结构的催化中心，其中His339和Cys129通过不同排列方式形成2 种不同构象，具有催化活性的“活化”构象（约30%）主要通过Asn341、His339和Cys129相互作用发挥作用，而无催化活性的“非活化”构象（约70%）中因Asp336 将His339 从原有催化位置拉出，Cys129发生转向从而形成无效的旋转异构体［5］。

线性泛素化修饰是近年发现的一种新型泛素链连接方式［1］。研究表明，OTULIN 催化结构域（cat⁃alytic domain of OTULIN，OTULINcat）的C129位点可与Met1-Ub特异性结合，且OTULIN催化结构域在物种间高度保守［4］。Ub 远端和近端分别与多个泛素结合位点S1 和S1'连接。S1 位点与远端Ub 的结合覆盖面积为1 045Å2，且该位点含有与螺旋臂（aa 254～264）相互作用的 Ile44。S1'位点与近端 Ub 的结合覆盖面积为 880 Å2，主要由 Ub 的 Helix 和 Phe4位点与OTULINcat 的α1 螺旋和α2 螺旋构成。大量S1'泛素结合位点对OTULIN 发挥去泛素化酶作用至关重要。S1'位点锚定近端Ub，将Met1 指向催化中心。除在空间上与Met-1 很接近的Lys63 外，其他近端Ub 的Lys 残基均远离催化中心。OTULIN 通过aa 125～127 和 aa 282～284 形成的 2 个环将连接点分开。非Met1-Ub 链，包括Lys63-Ub 在内的泛素链均可在一定程度旋转近端Ub，使OTULIN S1'位点与非Met1-Ub 链无法结合。研究发现，Lys63-Ub 与OTU⁃LIN 的结合能力低于Met1-Ub 与OTULIN 结合能力的 1%，Lys48-Ub 与 OTULIN 未检测到结合，表明OTULIN 的泛素结合点可在一定程度上特异性识别结构非常相似的Met1-Ub 和Lys63-Ub。当Ub 间含有完整的Gly76-Met1链序列时，OTULIN 可特异性分解 Ub，OTULIN 对含 Gly76-Met1突变的 tetraUb 无水解性。C129A、H339A 和 N341A 位点突变的 OTULIN也无法分解 Met1-Ub。S1（L259E 和 E314R）或 S1'（W96A 和TQK100-102AAA）位点的点突变可降低OTULIN 对 Met1-Ub 的亲和力，从而降低 OTULIN 的去泛素化酶活性［5］。

1.2 LUBAC 与 Met1-Ub LUBAC 最初由 日 本学者KIRISAKO 等［6］提 出 ，认 为 LUBAC 由 HOIL-1L（heme-oxidized IRP2 ligase，RIPK2）或 RBCK1（Ran BP-type and C3HC4-type zinc finger containing 1，RBCK1）、HOIP（HOIL-1L interacting protein）构成，HOIL-1L 和 HOIP 均为含 RING 类结构域的 E3 连接酶，HOIL-1L 与 HOIP 结合可特异性募集 Met1-Ub。TOKUNAGA 等［7］发现了 LUBAC 另一重要组分——Sharpin（SHANK-associated RH domain interacting protein），Sharpin 的 UBL 结构域可与 HOIP 的 NZF（NPL4 Zinc figer1）结构域相互作用，含 Sharpin 的LUBAC 可对 NF-κB 通路中的重要组分 NEMO 进行线性泛素链组装，从而激活NF-κB信号通路［8-10］。此外，Sharpin 基因无意义突变可导致小鼠慢性增生性皮炎，症状类似于X 连锁高IgM 综合征和低水肿外胚层发育不良的表现［11-12］。HOIP 对维持 LUBAC 活性至关重要，研究表明，仅有Met1-Ub富集不足以进一步激活 NF-κB 信号通路［5］。LUBAC 中仅 HOIP 可募集Met1-Ub，也是激活NF-κB 信号通路的先决条件。因此，LUBAC 被重新定义为包含Sharpin、HOIL-1L和HOIP的复合体［9］。

1.3 OTULIN 活性调节对 LUBAC 募集 Met1-Ub 的影响 OTULIN 通过保守的PIM 结构域与HOIP 的PUB 结构域特异性结合，该结合依赖于OTULIN 的Tyr56和 HOIP的 Asn102［13］。共表达 OTULIN 可抑制HOIP 泛素 化，表明 OTULIN 也 可 抑制 LUBAC 中HOIP 自身泛素化过程，对 OTULIN 拮抗 LUBAC 诱导的 NF-κB 激活至关重要［5，14］。OTULIN PIM 结构域中Tyr56 磷酸化可抑制OTULIN 与HOIP 结合，在一定程度上调节OTULIN 的去泛素化酶作用［14］。此外，生理条件下，非磷酸化OTULIN参与调节LUBAC募集Met1-Ub 过程，而磷酸化OTULIN 可通过抑制HOIP与OTULIN结合影响线性泛素链组装［5，14-16］。

ZHOU 等［17］在 1 个巴基斯坦和 2 个土耳其家谱中发现，含 OTULIN 错义突变（p. Leu272Pro 和 p.Tyr244Cys）和移码突变（Gly174Aspfs*2）的4 个患儿出现不同程度发热、中性粒细胞性皮炎/脂膜炎、生长发育受限、关节痛、进行性脂肪代谢障碍等症状，对TNF 抑制剂（英夫利昔单抗）和类固醇具有不同反应。值得注意的是，OTULIN 的3种基因突变并不影响 OTULIN 与 LUBAC 结合，OTULIN N 末端结构域对 OTULIN 与 LUBAC 的结合是必需的［17］。仅转染p.Leu272Pro和p.Gly174Aspfs*2过表达的质粒无法有效抑制HEK293 细胞内NF-κB 信号通路活性，表明p. Leu272Pro 和p. Gly174Aspfs*2 突变可影响OTULIN 的去泛素化活性，而p. Tyr244Cys 突变对OTULIN 酶活性无影响。患者成纤维细胞和外周血单核细胞内NF-κB 和MAPK 信号通路被明显激活，OTULIN 靶蛋白 NEMO、TNFR1、RIPK1 和 ASC 蛋白Met1-Ub 含量明显增多。DAMGAARD 等［18］发现，B细胞或者T 细胞OTULIN 基因敲除小鼠HOIP 和Sharpin 含量明显降低，HOIL-1 表达无明显变化，而骨髓细胞OTULIN 基因敲除小鼠HOIL-1 和HOIP 无明显改变，Sharpin 轻微降低，表明 OTULIN 对 LU⁃BAC 各组分表达影响不同，可能与调控的细胞类型有关，具体机制有待进一步研究。

1.4 OTULIN 与 NF-κB 信号通路 研究发现，OTU⁃LIN 可阻断 LUBAC 形成 Met1-Ub 从而抑制 NF-κB 信号通路激活［5，15，19-20］。OTULIN 缺失可导致包括 LU⁃BAC 在内的多种Met1-Ub 泛素化蛋白累积，但对TNF 诱导的HOIP 至TNFR1 这一过程无影响。但OTULIN 异位表达导致 TNF 诱导的 NF-κB 和相关促炎信号转导通路激活延迟［5，15］。TNFR1 信号传导通路中，OTULIN 分解 Met1-Ub 可抑制 NEMO 与 RIPK1结合［5］。OTULIN C129A 突变可导致 OUTLIN 催化活性丧失，但仍可导致体内NF-κB 活化程度降低，推测可能与突变的OTULIN 仍可结合泛素从而发挥负调节效应有关［5］。ZHAO 等［13］蛋白质组学分析发现，OTULIN 除与LUBAC 相互作用外，还参与TRIM32蛋白（tripartite motif-containing protein 32）介导的 NF-κB 信号通路，TRIM32 可通过 OTULIN 非去泛素化作用抑制OTULIN 与LUBAC 结合，TRIM32将K63-泛素链结合至OTULIN，阻断OTULIN 与HOIP 的相互作用，从而激活NF-κB 通路。因此，OTULIN 可多途径调控 NF-κB 信号通路，具体调控机制有待进一步研究。

1.5 OTULIN 与NOD2受体信号通路 细胞内PRR核苷酸寡聚化结构域蛋白2（nucleotide oligomeriza⁃tion domain containing protein 2，NOD2）可识别细菌肽聚糖的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）成分，各种病理刺激下，NOD2 与RIPK2 结合，募集细胞凋亡抑制剂（IAP）家族的Ub 连接酶［21］。研究发现，OTULIN 参与调节NOD2 受体信号通路。NOD2刺激可促进LUBAC 募集Met1-Ub 对RIPK2 进行线性泛素链组装［22］。OTULIN 沉默可致 RIPK2 蛋白的Met1-Ub 含量 增 高 ，与 NEMO 和 RIPK2 结合增多、NF-κB 信号通路激活增强有关，反之，OTULIN 过表达可抑制RIPK2蛋白Met1泛素化［15］。OTULIN 可限制RIPK2 蛋白Met1-Ub 组装速度并持续分解LU⁃BAC募集的Met1-Ub，少量配体刺激NOD2时该现象尤为显著，此外，NOD2和TNFR1刺激可导致受体组分Met1-Ub 混杂，该作用可被内源性OTULIN 抵消，LUBAC和OTULIN持平的活性作用可以解释为什么Met1-Ub在细胞中处于极低水平以及过表达LUBAC并不会明显促进Met1-Ub 在细胞内的富集，尽管有研究发现离体条件下LUBAC 可明显促进Ub 链组装［6，23］。DRABER 等［24］研究认为，OTULIN 未被招募至TNFR1 信号复合物，其主要通过调节细胞胞质LUBAC 复合体组分的Met1 泛素化水平，而不是调节RIPK1 和NEMO 等信号复合物自身的Met1 泛素化。但 WAGNER 等［25］发现，当 TNF 刺激后，TNFR1复合物存在低水平内源性OTULIN 表达，OTULIN 参与调节 NOD2 受体复合物中 RIPK2 的泛素化［3，15］。因此，OTULIN对受体信号复合物如TNFR1和NOD2的作用尚不明确。

2 OTULIN生物学特性

2.1 OTULIN 与细胞死亡 研究表明，OTULIN 过表达可抑制poly（I：C）诱导的NF-κB 信号通路激活。过表达OTULIN，经10 ng/ml TNF-α诱导的NF-κB靶基因转录水平降低。无OTULIN 过表达的细胞在TNF-α 刺激后15 min，细胞内IκBα 迅速发生磷酸化及降解，但过表达OTULIN 的细胞内 NF-κB 信号通路激活明显延迟［5］。OTULIN 过表达导致 TNF-α 诱导的细胞死亡敏感性降低，与Sharpin 缺失的cpdm小 鼠 及 HOIL-1 突 变 的 人 类 中 结 果 一 致［7-9，26-27］。KEUSEKOTTEN 等［5］发现，OTULIN 过表达可诱导细胞晚期JNK信号通路激活和c-Jun磷酸化，从而导致诱导细胞死亡的2 大分子PARP 和caspase-3 被剪切，HEK 293ET 和 U2OS 细胞中，敲除 OTULIN 基因可进一步增强poly（I：C）和TNF-α 诱导的细胞因子产生和 NF-κB 信号通路激活。TNF-α 刺激后早期IκBα 被轻度磷酸化和降解，晚期 JNK 和 c-Jun 持续磷酸化，促进细胞死亡。此外，RUNE BUSK DAMGAARD 等［20］发现，OTULIN 缺乏导致成纤维细胞和单核细胞对TNF 诱导的细胞死亡更加敏感。KEUSEKOTTEN 等［5］认为 OTULIN 过表达和敲除均可导致细胞死亡，具体机制有待进一步探索。

2.2 OTULIN 与ORAS ORAS也被称为otulipenia，主要由DUB 的OTU 结构域的纯合错义（p.L272P 和p. Y244C）和 移码 突变（p. G174Dfs*2）产生［18］。DAMGAARD 等［18］最初发现 3 个具有血缘关系的早产儿均表现出特发性炎症表型，婴儿在出生后即出现反复腹泻、血清高C反应蛋白、高白细胞和中性粒细胞等全身炎症反应，最后均进展为复发性结节性脂膜炎，并伴有不同程度中性粒细胞浸润、复发性发热、生长发育不良、关节疼痛肿胀及血清免疫球蛋白和自身抗体水平升高等。p. Y244C 和p.G174Dfs*2 突变患者体内 NF-κB、JAK/STAT 和 TNF信号通路被激活，激活程度与采样时患者症状严重程度呈正相关，此外，不同患者细胞内OTULIN 蛋白差异表达，OTULIN 含量与体内 NF-κB 信号激活程度呈负相关，此外，OTULIN 基因突变患者细胞内Met1-Ub 水平明显上升。英夫利昔单抗（Infliximab）可明显改善患者症状，降低外周血C 反应蛋白、白细胞和中性粒细胞含量至正常水平［18］。

2019年，DAMGAARD等［20］发现1例出生即出现严重全身炎症反应的阿拉伯女婴，全外显子组测序提示该患儿OTULIN 发生纯合子单碱基替换，即c. 841g>a，p. Gly 281 Arg。与 Leu272 和 Tyr244 相似，Gly281位于OUT 结构域，是位于螺旋α11和α12环上的保守位点。Gly28 与His282、Thr283 共同构成泛素结合位点，穿过活化位点直接与M1-Ub 远端结合。晶体结构分析发现，含Gly281Arg ORAS 突变的 OTULIN 催化结构域（OTULINcatG281R）采用类似OTULINcatWT的OTU 折叠方式，但引入的Arg 侧链无法装配于螺旋α3 和α9 间的狭窄口袋中，从而将GLy281 环从正常结合槽中翻转出来。对突变的OTULIN蛋白进行跨环高晶体学B因子分布分析，结果提示，与OUT 结构域内的其他区域相比，突变后的环柔韧性增强，从而影响M1-Ub 结合位点阻止底物结合，降低OTULIN 水解M1-Ub 活性。同OTU⁃LINC129A位 点 85 nmol/L 的 解 离 常 数 相 比 ，OTU⁃LINC129A/G281R与 M1-Ub 解 离 常 数 为 9.3 μmol/L。OTULING281R对M1-Ub 的水解活性低于OTULINcatWT的1/20～1/200。OTULING281R患者成纤维细胞中蓄积大量M1-Ub，且TNF-RSC 信号通路明显受损，此外，OTULIN 缺乏的人单核细胞内 NF-κB 信号通路被激活，TNF 分泌增多。DAMGAARD 等［20］发现，造血干细胞移植术可完全缓解患儿ORAS 相关症状，为该突变类型的ORAS 患者提供有效治疗方案。此外，NABAVI等［28］2019年也报道了一种新的OTULIN致病性变异体，即由OTULIN纯合子c.864+2 T>C突变（NM_138348）所致的全身炎症反应并导致患者死亡，晶体结构分析提示，突变的OTULIN 蛋白结构不稳定，且去泛素化酶活性明显降低。

OTULIN 在T 细胞、B 细胞和自然杀伤细胞中均有表达，在树突状细胞和巨噬细胞中含量尤为丰富。OTULIN 敲除小鼠表现出早发的严重全身炎症反应，体重明显下降，血清促炎细胞因子尤其是TNF、G-CSF 和IL-6 含量显著增多，中性粒细胞增多，组织内大量中性粒细胞浸润。OTULIN 发挥抗炎效应具有细胞特异性，T 细胞或B 细胞OTULIN 敲除小鼠无明显炎症表型，而骨髓细胞OTULIN 导致小鼠（LysMCre-OTULINLacZ/flox）出现严重的急性全身炎症反应，体内淋巴器官和肝脏明显肿大，外周血白细胞明显增多，以中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞增多为主［18］。虽然 DAMGAARD 等［18］发现 B 细胞和T 细胞OTULIN 沉默对小鼠体内Met1-Ub 募集无明显影响，但另有研究报道T 细胞和B 细胞参与Met1-Ub 募集过程［29-32］。因此，OTULIN 调节 B 细胞和T细胞内Met1-Ub的可能作用尚未明确。

2.3 OTULIN 与血管再生 OTULIN 基因突变与胚胎中时期血管形成缺陷密切相关。DAMGAARD等［19］发现，OTULIN 基因 336 位 Asp 突变为 Glu，可导致突变小鼠在胚胎期第12.5～14 d 死亡，突变小鼠头及躯干血管分支网络形成障碍、血管排列紊乱，在胚胎头部的中间区域，多个大直径脑血管分支形成分层血管网络，大的颅内血管扩张，血管分支减少，内皮细胞在分叉处聚集，OTULIN 可与Dishev⁃eled-2 蛋白（DVL2）结合，参与调节经典的Wnt 信号通路，对胚胎时期血管形成发挥重要作用。此外，研究发现，染色体5p15.2 位点基因丢失导致的人OTULIN 合成障碍可导致精神发育迟滞、神经及颅面发育畸形［33-35］。

2.4 OTULIN 与缺血性脑血管疾病 目前OTULIN在中枢神经系统（CNS）中的研究较少，仅在脑血管疾病中有报道。XU 等［36］研究发现，局灶脑缺血/再灌注损伤可诱导大脑内源性OTULIN 表达增多，且上调的OTULIN 富集于活化的小胶质细胞。过表达OTULIN 具有神经保护、减轻小胶质细胞介导的神经炎症反应的作用，该效应与脑内NF-κB 信号通路被抑制有关。鉴于OTULIN 参与外周免疫细胞及CNS 免疫细胞介导的炎症反应，对NF-κB 信号通路发挥重要的负性调节作用，推测OTULIN 可能对CNS 其他相关疾病发挥作用，是极具研究意义的靶点。

3 展望

OTULIN 作为一种新型的可特异性水解Met-Ub的去泛素化酶，参与包括细胞死亡、炎症反应和血管生成等多个重要的生理过程。但目前关于其去泛素化的具体机制研究较少，仍然存在许多需进一步探索的问题，比如OTULIN 对LUBAC 各组分表达影响的机制，磷酸化OTULIN是如何影响OTULIN的去泛素化效应？大量细胞研究证实OTULIN 可通过抑制NF-κB 信号激活从而有效减轻炎症反应，那是否OTULIN 参与调控减轻诸多由NF-κB 信号激活介导的疾病炎症损伤呢？因其强大的负性调控NF-κB信号通路，减轻炎症性损伤的效应，OTULIN 是一种有价值的、值得深入研究的去泛素化酶，有待成为一种新的治疗靶点。