兔动脉粥样硬化模型建立方法的研究进展

刘 鹏王广新苏国海

(山东第一医科大学附属中心医院心血管内科,济南 250013)

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病,是大多数心血管疾病的病理基础。 而冠状动脉粥样硬化斑块的不稳定和破裂是发生急性冠状动脉事件和猝死的最重要原因,所以心血管疾病早已成为威胁人类健康的头号杀手[1]。 目前,AS 的发生机制尚未完全阐明,为了更好地研究AS,需借助与临床相似的AS 动物模型,以此来研究其病理发生机制及诊疗等。 以兔建立的AS 模型,有助于进一步研究AS 发病机制,也有助于研发治疗AS 的新方法和新药物。

1 选择兔建立AS 模型的优势及评价标准

利用动物模型来研究人类AS 的机制已经有很长的历史。 1908 年,俄罗斯医生Ignatowski 和实验病理学家Anitschkow 用牛奶、肉和蛋等高胆固醇食物喂养兔子后,观察到主动脉内存在大量透明细胞(现在称为泡沫细胞)积聚的内膜损伤,这是最先建立的兔AS 模型[2]。 历经一个多世纪的发展,越来越多的学者认为,建立一种与人类相似的实验性AS动物模型对AS 的研究具有十分重要的作用。 常用于构建AS 模型的动物有小型猪、大鼠、小鼠、兔、非人灵长类动物等。 兔有独特的脂质代谢系统,这有助于研究人的脂质代谢。 其次,兔AS 的病理演化,从早期病变到晚期病变与人类相似[3]。 与大鼠相比,兔具有与人类相似的脂肪蛋白特征,并表达血浆胆固醇酯转移蛋白(cholesterolestertransferprotein,CETP)[3]。 可以增加AS 易感性和循环游离脂肪酸,这也是兔是对胆固醇最敏感的原因[4]。 除此之外,成年兔的体重比成年大鼠重约10 倍,因此兔子的脉管系统使得外科实验的研究成为可能。 例如支架和导管等介入治疗研究[5]中的冠状动脉插管以及结扎兔前降支结扎制备心肌梗死模型等。 与猪相比,兔AS 造模周期较短且花费较低,可选择性明显优于小型猪AS 模型[6]。

目前,一般选择血脂水平测定作为AS 模型是否建立成功的指标,这些指标主要包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、极低密度脂蛋白(VLDL)等[7]。 病理形态学检查主要观察是否有内膜增厚及斑块表面纤维帽改变等。 除此之外,多种成像系统(包括超声波、磁共振成像和正电子发射断层扫描)已被用于量化实验性AS 的大小或表征病变成分。

2 用于建立AS 模型的兔品种

目前用于建立兔AS 模型的有日本大耳白兔、新西兰白兔、青紫蓝兔、中国本兔四个品种,均属于封闭群动物,其中,前两者常用于建立兔AS 模型,后两者在文献中少有涉及[8]。 日本大耳兔的优点在于兔耳大,耳缘静脉血管清晰,便于重复取血及注射,如果采用小牛血清白蛋白或脂多糖等静脉注射法来建立兔AS 模型,日本大耳兔是一种理想的实验用兔。 新西兰白兔是目前用于心血管研究最常用的兔模型,与其它品系的兔相比,选育后的新西兰白兔具有生长速度快、饲料报酬高、繁殖性能优良、适应性能好、抗病力强、遗传性能稳定等特点。 而青紫蓝兔和中国本兔因体型偏小、生长速度缓慢,可选择性较差。

3 兔AS 模型的建立方法

3.1 喂养法建立兔AS 模型

兔在脂肪代谢方面与人类有相似之处,且血浆中富含的CETP 在AS 发生和发展中起重要作用。兔可以在肝中只合成对外源性胆固醇加快转运的载脂蛋白B,这就是兔可以短时间内仅通过单纯喂养高脂饲料就形成高胆固醇血症的最大优点,从而有利于兔AS 模型的制备。

3.1.1 单纯高脂饲料喂养法兔

张梦云等[9]选择高脂兔饲料(含1%胆固醇,7.5%蛋黄粉,8%猪油,0.5%胆酸钠,0.1%丙硫氧嘧啶和81%普通兔饲料)喂养4 周后发现兔高脂喂养组TC、LDL-C、HDL-C、VLDL 分别为对照组的17.7、29.2、4.2、25.8 倍,病理显示83%的兔模型存在早期AS,证明造模成功。 因为该方法造模操作过程简单,人工及外界因素干预少,而且成本相对低。 近年来, 有学者研究相关的非编码RNA,均采用了单纯高脂饲养的办法进行兔AS 造模。 缺点:造模时间相对较长,一些不稳定因素容易干扰造模的结果[10-12]。 例如,兔的个体差异会影响到高脂的实际摄入量。 另外,腹泻、食欲下降等个体因素可能会导致造模失败。

3.1.2 静脉注射脂多糖联合高脂饲料法

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分,也是内毒素的一种,是可以引起严重全身炎症反应的外源性物质之一,内皮细胞的损伤和LPS 有着密切关系。 而AS 形成过程中的始动环节就是内皮细胞的损伤和功能的改变[13]。 王县委等[14]采用静脉注射脂多糖联合高脂饲料的方法,在相同实验条件下,通过兔耳缘静脉注射不同剂量(100、200、1 000、2 000 ng/kg)的高纯级脂多糖引起发热性炎症反应,同时联合高脂饲料喂养建立兔AS 模型。 在造模的第5 周时,血脂检测已达到高血脂水平,病理形态学显示有粥样坏死斑块形成,说明静脉注射LPS 配合高脂饲料成功建立兔AS 模型。 Yang 等[15]在研究药物抗动脉粥样硬化作用与降血脂、减少泡沫细胞数量和内皮细胞损伤中选择了该建模方法。 这种利用炎症反应建立兔AS 的优点在于:可以在较短时间内成功建立与人类AS 病理形态学特点相似的兔AS 模型,用于今后AS 中炎症信号通路的研究。 这种方法建立兔AS 模型的缺点:容易在注射后引起兔的感染性休克,甚至导致死亡。

3.1.3 皮下注射L-蛋氨酸法

由于高同型半胱氨酸血症(HHcy)是AS 形成的一个独立危险因素,因此高同型半胱氨酸所致的AS 越来越受到重视[16]。 王晓萍等[17]采用L-蛋氨酸皮下注射法建立HHcy 兔AS 模型, 结果发现L-蛋氨酸皮下注射80 mg/(kg·d)4 周可建立HHcy 模型,12 周时动脉粥样硬化表现明显。 本方法建立兔AS 模型的最大优点:克服了单纯高脂喂养法建立AS 动物模型的不稳定性及周期长的缺点,另外,相对于注射脂肪乳和LPS,这种建立方法大大降低了因人工干预而导致的兔死亡率。 整个操作过程简单,且L-蛋氨酸相对容易获取,易于推广。 皮下注射L-蛋氨酸能建立特殊的兔Hhcy-AS 模型,对进一步探索HHcy 与AS 之间的联系,以及今后诊疗AS患者伴HHcy 都能起到十分关键的作用。

3.1.4 静脉注射小牛血清白蛋白法

李琳等[18]在喂养高脂饲料的基础上,喂养第1周初兔耳缘静脉一次性注射250 mg/kg 的牛血清白蛋白,10 周后进行血脂水平的测定和标本的采集。结果发现模型兔TC、TG、LDL 和HDL 水平均明显升高,病理检查发现内膜增厚,纤维帽薄在斑块表面形成,斑块坏死,视野内平滑肌细胞稀少,呈现典型的动脉粥样硬化斑块,证明兔AS 模型建立成功。近年来,唐云等[19]在中医药在AS 中的研究中均采用了此种建模方法,时间短、成活率高、模型稳定、可控性好是该方法建立AS 模型的优点。

3.2 机械损伤建立兔AS 模型

3.2.1 动脉球囊拉伤联合高脂喂养法

球囊拉伤加高脂饲料喂养建立颈、腹主、髂AS模型广泛应用于AS 的研究,模型建立方法也日趋成熟。 球囊拉伤建立过程:实验兔术前12 h 禁食,不禁水。 以3%戊巴比妥钠30 mg/kg 静脉麻醉,从耳缘静脉给予肝素200 U/kg,仰面固定[20]。 颈动脉球囊拉伤在正中切开皮肤5.0 cm 左右,暴露右侧颈总动脉后,远心端结扎,近心端用线提起,距颈内外动脉分叉点0.5 cm 约45 度角V 形剪开颈外动脉,逆行插入球囊(直径为2.5 mm×1.0 mm)约5 cm,再连接压力泵,注入肝素生理盐水,加压2 个大气压,自近心端缓慢回拉,反复3 次后撤出导管即可。股动脉拉伤是经右侧股动脉远端置入2.5 mm×20.0mm 球囊至股动脉近端,加压8 ～10 个大气压,然后拉动球囊由近端向远端剥脱血管内皮,最后抽出球囊即可。 球囊拉伤联合高脂饮食建立AS 模型的优点:内皮细胞经外力损伤诱发的AS 病变损伤接近于人AS 病变的发生发展过程,易于确定损伤病变部位,方便取材,成为目前建立兔AS 模型最常选用的方法。 缺点:血管内径与球囊内径较难匹配,兔血管直径相对较小,如多次穿刺失败容易导致血管痉挛或闭塞。

目前全球能源处于石油向清洁能源过渡的时代,原油和天然气在世界一次能源消费结构中占比呈下降趋势(仍超过50%)。但是随着能源需求的不断增长,再加上较低的油藏采收率(≤60%),可用的油藏消耗速度仍然日益加快。在节能减排的背景下,提高油藏的采收率对于保障能源安全具有重要意义[1]。

3.2.2 动脉球囊拉伤联合免疫注射法

兔的AS 病变可以通过单独喂食高胆固醇饮食或结合动脉球囊损伤而容易诱发。 与其他动物相比,兔对高胆固醇饮食敏感,可迅速发展为高胆固醇血症。 张晓奇等[21]通过超声结合病理,来评价斑块数量、大小、回声情况,以及制备病理切片,在HE染色及油红O 染色下观察其组织形态学变化及脂肪浸润情况。 发现高脂喂养加腹主动脉球囊拉伤术加注射小牛血清白蛋白比传统的高脂喂养加腹主动脉球囊拉伤所建立的AS 模型,更稳定、更高效。 这种方法最明显的优势在于:可以在相对短的时间内建立AS 模型,形成腹主动脉的动脉粥样斑块。

3.2.3 机械损伤联合维生素D 法

维生素D 可通过损伤动脉壁来诱发AS 形成,如平滑肌细胞增殖形成增生性纤维斑块。 李跃华等[22]运用球囊拉丝损伤腹主动脉内膜后,除每日的基础饲料外,再给实验兔每日每只加1.5 g 胆固醇,到术后的第11、12 周给实验兔皮下注射维生素D50万IU/kg,术后13 周取材,结果显示,皮下注射维生素D 的实验兔AS 病变脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为9.64%和1.56%,证明可成功建立AS 斑块模型。 机械损伤联合维生素D 注射建立AS 模型的优点:可以模拟人体病理状态下血管内钙化的病理生理改变,对于进一步研究药物治疗血管内钙化起到独特的优势。 弊端是操作过程中,注射维生素D 可能导致斑块内大范围、不均匀钙化,容易导致实验兔的死亡。

3.2.4 温控气体损伤与液氮冷冻损伤法

动脉粥样硬化易损斑块研究对急性心肌梗死、急性脑梗死等急性心脑血管疾病的治疗与预防都具有重要临床意义,但现今缺乏供研究的优质动物模型,但现在研究易损斑块的实验中,通常选用温控气体损伤法和液氮冷冻损伤两种办法。 路怀志等[23]利用恒定低温气体损伤兔颈动脉内膜,再结合高脂饮食12 周后发现,温控气体损伤组取材后病理下可见薄的纤维帽,内膜有巨噬细胞及泡沫细胞浸润,斑块出现裂隙,局部小血栓形成,形成典型的易损斑块,说明利用温控气体造模可以形成AS 模型。程卫平[24]通过实施液氮冷冻损伤,然后饲养高脂饲料8 周,再行液氮冻伤诱发斑块破裂试验后,病理下发现兔子均有斑块或闭塞性血栓形成。 李枚娟等[25]等人进一步确定了兔AS 易损斑块模型的建立方法,其优点在于:损伤血管可控,方法快速、廉价、可重复,而且大大降低了实验兔的死亡率,未来在AS 易损斑块研究中必然起到十分重要的作用。

3.3 其它方法建立兔AS 模型

3.3.1 空气干燥法

王琮等[26]采用颈总动脉内膜空气干燥法建立AS 模型,暴露右侧颈总动脉后,动脉夹夹闭血管近心端及远心端后,用4 号头皮针沿血管长轴刺穿,生理盐水冲管后通气(120 mL/min)5 min,随后再次往管腔内注入生理盐水,松开动脉夹,按压止血。 待出血停止后,缝合皮肤。 4 周后实验病理结果显示颈动脉可见内膜不规则增厚,证明建模成功。 上述方法建立兔AS 模型的优点在于:可以在最短时间内、在指定部位明确预定的斑块,但是最大的缺点是:操作过程中,大大增加了实验兔的死亡率。

3.3.2 基因敲除法

兔的脂质代谢特点十分接近于人体,因兔体内低密度脂蛋白含量高,且兔的肝不能编码载脂蛋白B48mRNA,只能合成载脂蛋白B100,这些都成为选择建立兔AS 基因模型的优势所在。 因此选兔作为制作ApoE-/-动物AS 模型的研究对象,也能更好地研究Apo E 在AS 中的作用[27]。 而利用基因编辑技术,敲除载脂蛋白E(ApoE)后,就可以建立稳定遗传的动物模型[28]。 现国内,袁婷婷等[29]借助近几年新兴的CRISPR/Cas9 基因编辑技术,编辑新西兰兔的ApoE 基因,并经PCR、TA 克隆、Sanger 测序、Western blot 和血脂检测鉴定ApoE 靶向敲除验证,已经成功建立F0代ApoE-/-模型兔,且可稳定遗传。相对于传统的ZENS、TALEN 等基因编辑技术,CRISPR/Cas9 基因编辑技术具有操作简单、敲除效率高、多位点同时进行等优点[30]。 Yuan 等[31]人利用多sgRNAs 引导的CRISPR/Cas9 系统对兔胚胎LDLR 和ApoE 基因进行编辑,成功建立了低密度脂蛋白受体(LDLR)和/或载脂蛋白(ApoE)基因大片段缺 失 的 兔 敲 除(KO) 模 型。 Lu 等[32]利 用CRISPR/Cas9 系统编辑低密度脂蛋白受体(LDLR)外显子7,成功建立了在正常饮食下自发地引起高胆固醇血症和动脉粥样硬化的LDLR-KO 模型兔,这在未来研究AS 以及家族性高脂血症都起到了十分重要的作用。

除了上述的基因编辑技术,渡边遗传性高胆固醇血症(WHHL)兔,现也常用于AS 研究。 WHHL兔是1973 年发现的一个突变体,现已证明,WHHL兔体内VLDL 残留物和LDL 不会被肝中LDLR 缺陷的肝细胞摄取,因此WHHL 兔体内保持LDL 等脂蛋白形式存在的高水平血浆胆固醇血症,且该品系相比日本大白兔的血清胆固醇和甘油三酯水平,升高约8～14 倍,除此之外,通过近亲交配可以持续传代高脂血症性状的品系。 随着科学的进步,通过CRISPR/Cas9 基因编辑建立的LDLR-KO 以及WHHL 兔会越来越多的应用到AS 疾病研究中,将会在心脑血管疾病研究中大放光彩。

4 展望

目前可用于建立AS 模型的动物主要有兔、鼠、猪和猴等,但没有任何一种动物模型是完美的。 兔是草食性动物,因此通过高脂饲养形成的AS 斑块纤维帽、脂质坏死核心等典型病理变化与人体存在一定的差异。 但是凭借着对外源性胆固醇较高的吸收率,以及对高脂血症的较低清除力,学者们依旧偏向于选兔来建立AS 模型。 多年来,国内外报道了很多兔AS 模型的建立方法,但大多数都是建立在高脂喂养和机械损伤的基础上。 除此之外,还有静脉注射维生素D、小牛血清白蛋白等方法。 机械损伤联合高脂喂养建立AS 模型虽然应用广泛,但可能会出现黄瘤病样斑块等问题。

随着基因编辑技术的崛起,相比鼠更接近与人类亲缘关系(基于DNA 序列分析)的兔,相信也会越来越多的应用生物医学领域中。 像CRISPR/Cas9等基因编辑技术的慢慢兴起,可以对兔基因组进行更有效和精确的编辑,以复制人类疾病建立模型,加快心脑血管等疾病的研究,应用前景也更加广阔。

AS 的发病机制和病理生理尚未完全阐明,将动物模型的研究应用推广到人类自身仍有许多困难。人体AS 斑块形成绝非炎症刺激、自身免疫反应等任何一种单一因素所导致。 未来精准医学的道路上,应将遗传、饮食、外界刺激等影响因素结合起来,建立最接近人体病理生理演变的兔AS 模型,并将兔AS 模型建立与临床药物试验和治疗有机结合,才能对人类AS 研究奠定坚实的基础。