乳腺癌前哨淋巴结活检光声示踪剂的进展与展望

赵家贤，王春建，丛斌斌，王永胜

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东 济南 250062；

2.山东省肿瘤防治研究院（山东省肿瘤医院）乳腺病中心，山东 济南 250117

乳腺癌区域淋巴结转移情况是影响乳腺癌患者预后的重要因素。前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN）的状态可反映腋窝区域淋巴结转移情况。研究［1］表明，对于早期乳腺癌患者，腋窝前哨淋巴结活检术（sentinel lymph node biopsy，SLNB）已可取代腋窝淋巴结清扫术成为治疗早期乳腺癌区域淋巴结转移的首要方案，从而减轻腋窝淋巴结清扫带来的并发症，如上肢淋巴水肿、感觉异常及运动障碍等。

目前国内及国际指南推荐蓝染料联合核素示踪法作为SLN的定位方法［2-3］，这是当前SLN检出率最高的方法。然而蓝染料颗粒直径较小，不具有靶向性，易将次级淋巴结染色，存在较高的假阴性率［4］。核素存在放射性污染的问题，其制备过程复杂且需严格质控，限制了放射性核素示踪剂在临床中的推广［5-6］。常用的荧光示踪法以荧光脉管系统成像，荧光示踪剂发出的荧光穿透厚度低，较难发现位置较深的SLN，解剖分离过程中易切断淋巴管导致荧光示踪剂泄露导致周围组织荧光污染，难以识别并定位SLN［7-8］。

研发具有靶向性、价格低廉、易质控和较好可视性的新型示踪技术和示踪剂势在必行。光声成像（photoacoustic imaging，PAI）是近年来新兴的成像技术，本文介绍PAI成像原理，重点对光声造影剂在乳腺癌SLNB中的应用研究进展进行综述，并展望通过PAI技术将新型荧光靶向示踪剂应用于乳腺癌SLNB的未来前景。

1 PAI与光声造影剂

PAI依赖于光热转换，生物内源性生色基团或外源性造影剂吸收脉冲光引起局部热弹性膨胀，随后向外辐射超声波，由于不同组织成分的光吸收系数不同，超声换能器可以检测到不同强度的超声波，分析处理后可形成生物组织光能吸收差异分布图，即成像。PAI不仅结合了光学成像高对比度和超声成像高穿透力的优势，还能通过光声造影剂获得组织功能及相关分子信息，有助于组织结构形态、生理、病理学特征和代谢功能等的研究，在机器的深度学习后不断迭代，在生物医学领域具有广阔的应用前景［9-12］。

除应具有生物医学制剂的低毒性、低致热原性特性外，良好的光声造影剂还应具有以下特性［9-10］：高摩尔吸光系数（最大程度吸收脉冲光）、近红外光吸收峰、高光热转换效率、高光稳定性（确保光谱特征不受光线照射而改变）、低量子产率（激发态电子的弛豫可以发生在辐射或非辐射过程中，取决于造影剂处于激发态的时间和其电子构型。PAI需要非辐射弛豫，所以荧光发射的量子产率应尽可能低）。

PAI作为一种非侵入性分子成像技术，已广泛应用于研究与临床中，如脑、甲状腺、乳腺及淋巴结成像，乳腺癌的转移抑制及治疗等［13-19］。近年来用于乳腺癌SLNB研究的PAI造影剂主要包括小分子近红外染料、金属或半导体纳米材料和有机纳米材料［10，25］。

2 应用于乳腺癌SLNB的光声造影剂

2.1 菁染料

菁染料中的吲哚菁绿［20］（indocyanine green，ICG）是常用的小分子近红外染料，是一种获得中国食品药品监督管理局批准的低毒染料，在荧光染料中有较高摩尔吸光系数（2.3×105/M·cm）。在水溶液中，ICG的光吸收峰在波长780 nm处，在此波长可获得在荧光染料中较低的荧光量子产率（0.027）。ICG能迅速与血浆蛋白结合，所以临床上常被用作血流造影剂［27］。

近年来，ICG被提出可作为乳腺癌SLNB的示踪剂。Papathemelis等［21］的研究和Guo等［22］的研究显示，ICG通过荧光成像系统用于SLNB显示出与核素法相同的检出率（98%）和比蓝染料法更高的检出率（97%vs89%）。然而其不具备靶向性，同时Ahmed等［7］的研究显示ICG发出的荧光穿透厚度约为9 mm，较难发现位置较深的SLN。

Song等［23］早期报道了亚甲蓝作为PAI造影剂用于乳腺SLN的鉴别，他们通过在小鼠SLN上叠加鸡胸组织增加成像深度，获得了深度达30 mm的SLN图像。此外，Kim等［24］用ICG通过同样方法在小鼠实验中获得了22 mm深度SLN的光声图像。Sivasubramanian等［25］联合PAI及超声双模态成像系统对比了MB与ICG染色后的乳腺癌SLN成像，结果显示这两种染料均显像良好，成像深度达1.5 cm，并实现了实时SLN细针穿刺。

ICG在实际应用时，SLN解剖过程中易切断淋巴管导致荧光示踪剂泄露从而导致周围组织荧光污染，难以识别并定位SLN，同时，其荧光穿透厚度低。这些局限性限制了其在临床推广，近年来学者们研究通过将ICG涂层于超顺磁性氧化铁和纳米碳材料、与小分子抗体耦合等方式形成新型化合物，以满足实际应用需求［26，31］。

2.2 贵金属纳米颗粒

由于局部表面等离子共振效应（当暴露于适当波长的光时，纳米颗粒表面导电电子在阳离子晶格的共振频率下相互振荡，振荡能大部分转换成PAI所检测的热能），贵金属纳米颗粒具有优异的光吸收和特殊的光热转换能力，其摩尔吸光系数比小分子染料高多个数量级，是近红外光范围内最高摩尔吸光系数的造影剂，具有高光声转化效率［12，27-28］。

金纳米颗粒（Au nanoparticle，AuNP）长期以来被广泛用作PAI造影剂。AuNP可以在激光照射下实现高光热转换效应［29］，具有很高的生物相容性、良好的化学惰性、优异的理化性能和高的消光系数［30］。

AuNP的缺点是长时间暴露于激光照射后易发生形变，影响光声信号并导致成像结果随时间延长而不一致。Luke等［31］研究将二氧化硅涂层于AuNP上形成Si-AuNP，二氧化硅涂层提供了一个保护壳，保护Si-AuNP免受激光诱导的光热降解，使其可在持续的PAI过程中保持颗粒的热力学稳定性。他们以小鼠口腔鳞状细胞癌为模型，通过PAI在波长1 064 nm处定位Si-AuNP，以获取PA图像。Dumani等［32］使用PAI联合超声系统，结合聚乙二醇-壳聚糖涂层金纳米粒子（GCAuNP）作为成像造影剂来检测SLN转移，组织学分析证实，GC-AuNP标记的免疫细胞的分布因转移细胞的存在而改变，成功地区分出了转移性淋巴结和非转移性淋巴结。预计该方法可以帮助检测SLN微转移，从而指导SLNB。

在合成过程中，AuNP存在潜在细胞毒性，体积较大时被网状内皮系统摄取后不能完全从体内清除，其短期和长期安全性尚需前瞻性研究验证。此外，AuNP价格较其他光声造影剂贵，临床应用受到限制。

2.3 碳纳米材料

碳纳米材料由于合成和官能化的灵活性在PAI中应用广泛，其摩尔吸光系数高于小分子近红外染料，其中广泛用于PAI的是碳纳米悬浮液（carbon nanoparticle suspensions，CNS）。作为PAI造影剂，碳纳米材料的吸收光谱相对较宽，在400～1 100 nm的光谱上具有强而宽的吸光度（包括紫外光、可见光、近红外光和微波），在吸收光谱内无明显的吸收峰［27，36］。

CNS以其黑染的特性被应用于SLNB，其直径为150 nm，可通过淋巴管（100～500 nm）而不会进入毛细血管（20～50 nm）。CNS具有淋巴系统趋向性，注射后迅速进入淋巴管，聚集在淋巴结，使淋巴结染成黑色，从而达到检测SLN的作用。Zhang等［33］研究发现，以CNS为示踪剂行SLNB，SLN的检测率为99.1%（329/332）。Yang等［34］研究发现，以CNS为示踪剂行SLNB成功率为99.59%，准确率为97.06%，灵敏度为93.22%。此外，在4例患者中发现假阴性，假阴性率为6.78%。

单独通过CNS的黑染进行SLNB具有一定的局限性，黑染较浅的SLN可视性较差，此外其对于淋巴管的染色较差，实际操作时易遗漏SLN。De La Zerda等［35］将ICG染料涂层于单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotube，SWCNT）表面使PA信号增强，同时使其具有特定的吸收光谱，合成物SWCNT-ICG在780 nm时的光学吸光度比普通SWCNT高出20倍，并与其他分子基团结合也能维持高光声对比。Liu等［36］以CNS为示踪剂应用PAI联合超声的方法对SD大鼠SLN行细针穿刺，结果显示，该方法能够敏感地识别SLN，并可提供高对比度的图像引导。

通过ICG的涂层后，以CNS的黑染特性联合PAI及超声方法，其或可成为新型荧光靶向示踪方法，但仍需进一步前瞻性研究验证。

3 小分子近红外染料与利妥昔单抗联合

抗体染料偶联物最近被用于乳腺癌的高度特异性分子PAI［37］。利妥昔单抗（rituximab，Rit）是一种针对淋巴结中B淋巴细胞膜上CD20分子的特异性人源化单克隆抗体，用于治疗CD20+的淋巴瘤及免疫相关疾病，能够与淋巴结内B淋巴细胞膜上的CD20分子特异性结合，并且结合后不易解离，另外其具备有与其他小分子结合的结构域，能够与小分子物质进行偶联反应。

吴爽等［38］将ICG与Rit进行偶联，形成一种新型的荧光靶向示踪剂ICG-Rit，其可与SLN特异性结合，通过荧光成像仪标记的发光淋巴管及淋巴结即为SLN，结果显示，ICG-Rit显像淋巴结的准确率为97.0%（97/100），灵敏度为96.2%（25/26），特异度为100.0%（26/26），假阴性率为3.8%（1/26），阴性预测值为98.6%（71/72），阳性预测值为100.0%（25/25）。荧光法对比联合法的一致性评价，Kappa值为0.973（P＜0.001），表明有极好的一致性。在临床应用过程中发现，该示踪剂仍存在SLN发射荧光难以穿透较深腋窝组织的缺陷。

丛斌斌等［39］研究将利妥昔单抗与菁基染料CY754耦合，形成一种较ICG-Rit穿透力更强的示踪剂CY754-Rit，并将其探测SLN的结果与ICGRit示踪结果进行比较，同时进行CY754-Rit毒性研究，结果显示，CY754-Rit 所激发出荧光穿透薄层脂肪组织的最大厚度为22 mm，ICG-Rit样品的发射荧光穿透薄层脂肪组织的最大厚度为10 mm，同时该研究显示，CY754-Rit对实验大鼠来说是无急性毒性、无肝肾毒性且代谢后无脏器残留的化合物。

有研究［8，39］显示，将菁基染料CY754与Rit耦合的新型示踪剂为无菌、无致热原的溶液且局部注射不会产生危害；Rit与ICG质量比例为4∶1、6∶1偶联形成的新型示踪剂，SLN显像效果最佳。田崇麟等［40］研究显示，ICG-Rit的最佳注射剂量为0.12 μg，达最佳显像时间约为34 min，该示踪剂能清晰定位SLN且6 h内无次级淋巴结显像，具有较高的临床应用价值。

4 展望

以往菁基染料以其荧光特性对SLN的显像仍具有局限性，通过PAI技术或可提高乳腺癌SLN的检测率。ICG和CY754具有较高的摩尔吸光系数、近红外光吸收峰、较高光热转换效率。同时，其价格较低廉、易质控、具有较好的可视性。ICG及CY754与利妥昔单抗偶联后，其光稳定性提高，同时可以与淋巴结特异性结合，一定剂量下靶向引流至SLN，利用PAI技术提高成像深度，可避免荧光成像仪无法全景观察腋窝淋巴结引流状况的问题。菁基染料与利妥昔单抗偶联形成的新型荧光靶向示踪剂制备工艺简单且无放射性危害，为无菌、无致热原、无急性毒性的示踪剂，能够用于SLN显像。预计该新型荧光靶向示踪剂将兼具光声造影剂和抗体型靶向示踪剂的优点，避免了传统示踪剂的缺点。通过PAI技术可成为乳腺癌SLNB的理想示踪方法，具有良好的临床应用前景。