间充质干细胞对T细胞免疫调节机制的研究进展①

王方迪 侯瑞霞 李俊琴 李新华

（山西医科大学附属太原中心医院皮肤科，免疫性皮肤病干细胞山西省重点实验室，太原030009）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的多能干细胞，具有低免疫原性和免疫调节等生物学特性，在不同诱导条件下，MSCs可分别向骨、软骨、心肌细胞、肝细胞、脂肪细胞及神经细胞等分化［1］。MSCs 的来源广泛，可从骨髓、血液、脂肪组织和脐带等多种组织中分离获得［2-4］。MSCs是一类具有免疫调节作用的细胞，大量文献报道了其发挥免疫调节作用的机制，研究发现其可通过对抗原提呈细胞、NK细胞、B细胞、T细胞、调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）等免疫细胞的影响来发挥免疫调节作用［5-6］。

T 淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，在胸腺中分化成熟，在淋巴细胞中数量最多，功能最复杂。在受到进入机体的抗原激发后，未活化的静息型T细胞会活化增殖，并分化为效应T细胞，从而发挥细胞免疫作用。根据CD4 和CD8 表达不同，T 淋巴细胞可分为CD4+T 淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞，其中，CD4+T 淋巴细胞又分为Th1、Th2、Th17 和Treg，分别分泌不同的因子，发挥不同的免疫效应［7］。Th1分泌的细胞因子包括IL-2和IFN-γ等，Th2分泌的细胞因子包括IL-4、IL-5 和IL-6 等，Th17 主要分泌IL-17，Treg 是一类控制体内自身免疫反应性的T 细胞亚群，在减少机体炎症损伤和保持机体自身耐受等方面发挥重要作用。而CD8+T淋巴细胞主要为细胞毒性T 淋巴细胞。T 细胞是获得性免疫的主要效应细胞，广泛参与从信号识别、抗原提呈，到炎症因子的释放、其他免疫细胞的激活和趋化等多个免疫反应过程［8］。MSCs 作为一种具有免疫调节作用的细胞，在多个环节均可抑制T细胞功能。

1 MSCs对T细胞的抑制作用

T 淋巴细胞被激活后，可大量增殖并向不同的亚型分化，同时释放不同的炎症因子，以发挥其效应功能。MSCs 可调节其活化、增殖、分化及细胞因子分泌等不同环节，从而影响T 细胞的免疫效应。MSCs 对T 细胞的免疫调节机制尚不完全明确，细胞间的直接接触及可溶性细胞因子等可能参与抑制体内外T 淋巴细胞的活化和增殖过程，已经发现的介导MSCs免疫抑制功能的细胞因子包括TGF-β、肝细胞生长因子（hematopoietic growth factor，HGF）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、IL-10、吲哚胺2、3-双加氧酶（indolamine2，3-dioxygenase，IDO）、一氧化氮（NO）、血红素氧合酶1、IFN-γ等［9-10］。

1.1 活化 T 淋巴细胞的活化是免疫应答的核心，诱导T 细胞活化需要双重信号刺激：第一信号由T细胞受体（T cell receptor，TCR）传导并由黏附分子增强；协同刺激信号由抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）表面的协同刺激分子和T 细胞表面相应的受体相互作用产生，可增强TCR 信号，只有在双重信号的作用下T 细胞才可被充分活化，继而增殖并分化为效应T 细胞参与免疫反应。T 细胞活化的表面标志包括CD25、CD69、细胞因子IL-2、IFN-γ等，MSCs对T细胞活化的影响存在争议，YOO等［11］发现MSCs 可抑制T 细胞表面CD25 表达，LI等［12］研究证实MSCs 可通过下调NKG2D 表达抑制CD8+T 细胞活化，然而RAMASAMY 等［13］发现MSCs抑制T 细胞的增殖，而对T 细胞的活化没有影响，与此同时，研究发现MSCs 可促进T 细胞的早期活化，上调CD69 表达［14-15］。MSCs 对T 细胞活化的影响不同可能与作用于不同的T 细胞亚群或MSCs 是否处于炎症环境中有关。

1.2 增殖 已有大量研究表明，MSCs 以剂量依赖的方式抑制T 细胞增殖，可能是通过直接接触和MSCs 分泌的细胞因子发挥作用，包括TGF-β、HGF、IDO、PGE2等在内的可溶性因子在这一过程中起主要作用［16-18］。MSCs与T细胞直接接触是否必需尚存在争议，DI NICOLA 等［9］用Transwell 系统共培养发现，避免两者直接接触后，T 细胞的增殖仍然受到明显抑制，考虑是可溶性因子发挥作用，因此认为MSCs 与T 细胞的直接接触并不是引起增殖抑制的必要条件。类似地，RASMUSSON 等［19］认为MSCs 主要通过可溶性因子而非与T 细胞直接接触发挥作用。然而，有研究则发现二者的直接接触必不可少，可能与程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）、人白细胞抗原-G1（human leucocyte antigen-G1，HLA-G1）等有关［20-23］。

MSCs 抑制T 细胞分裂增殖，研究证明MSCs 可阻断T 细胞周期，使T 细胞滞留在G0/G1 期［17，23］。在分子水平，CDK2 和细胞周期蛋白D2 表达被抑制，细胞周期调控因子p27kip1 表达上调［24］。而对于MSCs 是否诱导T 细胞凋亡，尚无明确定论，GIULIANI 等［23］认为骨髓MSCs 对T 细胞的凋亡没有影响，但也有研究认为MSCs 可诱导T 细胞的凋亡［24-27］。而BENVENUTO 等［28］发现MSCs 对T 细 胞凋亡有保护作用。

1.3 分化及效应功能 T 细胞在受到刺激后会分化为Th1、Th2、Th17 和Treg，分泌相应的细胞因子，发挥抗炎、促炎及维持免疫平衡等效应功能。很多研究发现，MSCs 可调节T 细胞分化，影响其各亚群平衡，从而调控其效应功能［29-40］。

JIA 等［29］观察了MSCs 在大鼠角膜移植排斥反应中的免疫调节作用，检测T 细胞产生的Th1/Th2细胞因子水平，发现注射MSCs后，T细胞分泌的Th1型促炎因子的水平如IL-2、IFN-γ 显著降低，而Th2型细胞因子IL-4、IL-10 升高。然而李慧等［30］在探究狼疮鼠和正常鼠骨髓MSCs 对T 细胞的免疫作用时则发现T 细胞与正常鼠骨髓MSCs 共培养后，Th2 型细胞因子IL-4 水平降低，Th1 型细胞因子IFN-γ、IL-12 水平升高，类似的实验还有很多，这些结果均表明MSCs 可调节Th1/Th2 平衡［31-32］。MSCs 还可调节Th17 的产生，Th17 是一种CD4+T 细胞亚群，以分泌IL-17为特征，IL-17具有促炎症作用，诱导促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α）、趋化因子等表达，MSCs 可通过抑制转录因子RORγt 抑制Th17 细胞亚群的分化，并分泌PGE2等可溶性细胞因子引导Th17 向抑制性Treg转化［33-35］。

此外，MSCs 还可诱导产生Treg。Treg 是T 细胞中具有免疫抑制功能的亚群，根据Treg 的表面标志不同，分泌的细胞因子和作用机制不同，可分为CD4+CD25+Treg、Tr1 和Th3 等多种亚型。CD4+CD25+Treg 可高表达IL-2 受体的α 链（CD25）分子和转录因子FOXP3。Tr1是在IL-10诱导下产生的CD4+T细胞。Th3 主要分泌TGF-β，对Th1 和Th2 都具有抑制作用。MSCs可通过分泌HLA-G5和非经典的HLA-G扩增Treg，通过促进IL-10 的分泌诱导Tr1 细胞产生，这一过程可能与MSCs 分泌的PGE2、IDO 等细胞因 子 有 关［21，36-37］。 同 时，Tr1 也 可 分 泌IL-10 促 进MSCs 分泌HLA-G5，后者又进一步诱导产生Treg。AKIYAMA 等［38］认为MSCs通过FAS/FASL通路诱导T 细胞凋亡和Treg 产生。YAN 等［39］则发现MSCs 通过上调PD-1 诱导可产生高免疫抑制能力的Treg。而DEL PAPA 等［40］研究发现MSCs 与CD4+T 细胞共培养时激活Notch1 通路，用GSI-Ⅰ或中和抗体阻断Notch1 信号传导后，其下游靶点HES1 表达降低，负调控因子FBW7表达增加，FOXP3的表达显著降低，且MSCs 诱导产生的CD4+CD25highFOXP3+细胞大幅减少，说明Notch1 通路在MSCs 诱导Treg 的产生中发挥重要作用。

2 调节机制

MSCs 对T 细胞的抑制作用可通过可溶性细胞因子、细胞间直接接触及分泌外泌体等多种方式实现。具体以哪一种方式为主，或者是否有多种不同的方式协同作用，不同的研究中有不同的结论。实验证明，可溶性细胞因子或外泌体在MSCs抑制T细胞的过程中发挥重要作用，这一过程涉及的细胞因子主要包括TGF-β1、HGF、IDO、PGE2、HLA-G 等［9-10，41］。此外，PD-1、HLA-G、Jagged-1 和细胞间黏附分子1（ICMA-Ⅰ）、血管细胞黏附分子1（VCAM-Ⅰ）等介导的细胞间直接接触也被证实在MSCs 对T 细胞免疫调节中发挥重要作用。

2.1 可溶性细胞因子

2.1.1 TGF-β1 和HGF TGF-β1 和HGF 两种细胞因子均可抑制同种抗原激活的T 淋巴细胞的增殖，加入中和抗体后可部分恢复T细胞增殖［9］。TGF-β1还 参 与MSCs 诱 导 产 生CD4+CD25+FOXP3+Treg［36］。这些结果说明，TGF-β1 和HGF 参与了MSCs 对T 细胞增殖的抑制。

2.1.2 IDO IDO 是一种催化色氨酸转化为犬尿氨酸的酶，T 淋巴细胞的增殖受抑制是由于色氨酸的消耗或犬尿氨酸的积累［42］。已有实验证实，在MSCs存在时，添加外源性色氨酸可恢复同种抗原激活的T 细胞增殖，加入IDO 的竞争性抑制剂降低了MSCs 对同种抗原激活的CD4+T 淋巴细胞的免疫抑制作用，IDO 还参与抑制Th17 的分化及FOXP3+Treg的产生［42-44］。此外，MSCs 表达IDO 依赖IFN-γ，实验观察到将MSCs 置于炎症环境时（如IFN-γ）可抑制T细胞的增殖［43］。

2.1.3 PGE2PGE2是花生四烯酸环氧合酶的代谢产物，MSCs通过环氧合酶生成PGE2，进而激活IDO，二者参与Treg 的诱导产生，当PGE2及IDO 被同时阻断后，IL-10+IFN-γ+CD4+Treg 亚群会大量减少，免疫反应可恢复［45-46］。很多研究都发现PGE2在MSCs 的免疫调节中发挥重要作用，包括抑制T细胞增殖、影响T细胞分化及细胞因子产生［47-49］。

2.1.4 IL-10 IL-10 由Treg 淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生，可抑制促炎细胞因子（如IL-2、IL-3、TNF-α 等）的产生，促进HLA-G5 的表达和分泌，同时还可抑制树突状细胞及巨噬细胞共刺激分子的表达［50］。中和抗体实验表明IL-10 在MSCs 介导的免疫调节中发挥作用，并可诱导Treg 产生［51-52］。CD4+CD25+Tregs 与MSCs 共培养后免疫抑制能力增强，可能是由于共培养上清液中IL-10 刺激Tregs 上的PD-1高表达所致［39］。

2.1.5 NO NO 由诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）合成，当MSCs 与CD4+、CD8+T细胞接触时，iNOS可合成NO。Stat5是T细胞活化和增殖的重要转录因子，在MSCs 存在时，T 细胞中Stat5 磷酸化被抑制，NO 参与了抑制Stat5 磷酸化和T 细胞增殖［53］。ZHANG 等［54］用炎症因子处理MSCs，发现可诱导其产生细胞因子信号传导抑制分子1（SOCS1），敲除SOCS1 的MSCs 免疫抑制能力增强，进一步证明，SOCS1 通过降低iNOS 表达抑制MSCs 的免疫抑制能力，提示NO 可能参与MSCs 介导的免疫调节。

2.2 细胞间接触

2.2.1 PD-1 PD-L1（B7-H1/CD274）及 其 受 体（PD-1/CD279）是T 淋巴细胞共刺激通路的组成部分，激活后释放抑制和调节信号，该通路参与促凋亡和终止免疫应答以避免组织损伤［55］。PD-1/PD-L1通路在持续的抗原刺激下被激活，该通路的激活可抑制自身免疫，并通过调节T 淋巴细胞直接导致免疫抑制微环境。在小鼠模型和人类MSCs 中，已经观察到用IFN-γ 诱导后MSCs 的PD-L1 表达增加，用中和抗体证明PD-L1 参与MSCs 介导的免疫抑制［55-56］。YAN 等［39］用人骨髓MSCs 与活化的Treg 共培养，发现Treg 的PD-1 表达上调，同时Treg 的免疫抑制作用增强，而用人骨髓MSCs 与活化的CD4+CD25-Tconv 细胞共培养后，CD4+CD25-Tconv 细胞的PD-1 表达也增高，同时MSCs 表达PD-L1，PD-1与PD-L1 结合后引起CD4+CD25-Tconv 细胞凋亡，且PD-1 高表达的CD4+CD25-Tconv 细胞凋亡的数量较PD-1低表达的多，表明MSCs作用后活化Tconv细胞的凋亡与PD-1/PD-L1通路的激活有关［25］。

2.2.2 HLA-G HLA-G 分子是非典型的HLA 分子，具有有限的等位基因多态性和组织特异性表达模式。有膜结合的亚型（HLA-G1、G2、G3、G4）和可溶性亚型（HLA-G5、G6、G7）［57］。IL-10 可促进MSCs表达膜结合亚型HLA-G1 和可溶性亚型HLA-G52种分子［21］。同样，HLA-G5可正反馈刺激IL-10分泌，同时使用针对这两种分子的抗体几乎可以在MSCs存在时完全恢复同种抗原激活的PBMCs 的增殖［58］。MSCs 与T 细胞的直接接触可建立正反馈通路和免疫抑制环境，二者接触产生的CD4+CD25+FOXP3+Treg 也可加剧这一过程。类似的研究也说明了MSCs和T细胞间接触的重要性［20］。

2.2.3 ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ 黏附分子ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ已通过抗体证明参与MSCs 对T 细胞的免疫调节作用［59］。用IFN-γ 刺激MSCs 后，ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ表达增加，在小鼠模型中阻断二者表达后，会显著抑制MSCs的免疫调节功能［36，59］。黏附分子可能通过诱导T 细胞上CTLA-4 的表达参与T 细胞免疫调节，活化的CD3+淋巴细胞与MSCs 的细胞间接触可增加CTLA-4 的表达［20，60-61］。然而，对于人类而言，ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ对MSCs 抑制T 细胞的增殖似乎并不是那么重要。

2.3 胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs） EVs 是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40～1000 nm 不等，主要由微囊泡（microvesicles，MVs）和外泌体（exosomes，Exs）组成。最近发现，MSCs的免疫调节功能在很大程度上是由旁分泌信号介导的，MSCs分泌的胞外囊泡也参与这种调节作用，并且被认为是关键的旁分泌因子，其携带各种生物分子，如RNA（mRNA、miRNA）和蛋白质（膜受体、酶、细胞因子和生长因子），因此具有免疫调节特性［62］。MSCs 通过将其生物活性物质从亲代细胞转移到受体细胞，在细胞与细胞的相互作用中发挥重要作用，MSCs的免疫调节作用在很大程度上依赖于EVs的分泌［63-64］。

MSCs 分泌的EVs 在T 细胞抑制中的作用越来越受到关注［65-67］。与MSCs 的功能类似，EVs 也可抑制效应T 细胞的分化、活化和增殖，诱导T 细胞凋亡，促进Treg 生成［68-71］。MOKARIZADEH 等［68］首次从IL-1β 激活的小鼠MSCs 中分离出EVs，其作为MSCs 的特异性细胞分子（如PD-L1、TGF-β 等）的载体。MSCs-EVs 可抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自身反应性淋巴细胞的活化和增殖，诱导T 细胞凋亡，促进抗炎因子（IL-10、TGF-β）的分泌及Treg的产生。FAVARO 等［69］探究了1 型糖尿病的骨髓MSCs 来源的EVs 能否模拟MSCs 的免疫调节功能，发现MSCs-EVs 能够干扰抗原诱导的免疫反应。通过检测IFN-γ 的表达发现，MSC-EVs 能够抑制体外Th1 产生，诱导Treg 产生，减少Th17 产生，MSCs-EV作用T 细胞后，T 细胞可分泌PGE2和TGF-β。因此，MSCs-EVs 可调节Th1/Th2 平衡，增加Treg 在1 型糖尿病中的比例。此外，BLAZQUEZ 等［70］用脂肪来源的MSCs分泌的EVs作用于活化T细胞后发现CD4+、CD8+细胞减少，同时，T细胞表达的IFN-γ水平降低。提示MSCs-EVs不仅影响T细胞的表型分化，还可影响其细胞因子的表达。

但也有研究证实，EVs 的效应并不能等同于MSCs 本身。CONFORTI 等［72］对骨髓MSCs 及其分泌的EVs 的免疫调节作用进行了比较，发现相比MSCs-EVs，MSCs 能更有效地抑制体外T 细胞增殖。MSCs-EVs 作用T 细胞后，IL-10、TGF-β 分泌增加，GM-CSF、IFN-γ 分泌减少，但MSCs 直接与T 细胞共培养时，细胞因子的增加或减少都更明显，说明EVs仅能发挥MSCs的部分效应。并且，由于EVs计数困难和EVs 与靶细胞的比例难以确定，在比较EVs 和MSCs的免疫调节能力时应考虑其局限性。

3 小结与展望

MSCs具有免疫调节功能，可调节多种免疫细胞的功能，特别是T 细胞，MSCs 可明显抑制T 淋巴细胞的活化、增殖和细胞因子分泌，显著上调Treg 比例，进而影响其他免疫细胞功能，鉴于这些特点，MSCs 已被用于包括GVHD 在内的自身免疫性疾病的治疗，并取得了积极的结果［73］。然而，MSCs 对T 细胞的免疫调节机制尚不完全明确，因此进一步探讨其确切的作用机制，将为MSCs 的实验室研究及临床治疗提供重要的理论支持。