MicroRNAs在黏膜屏障及炎症反应中的作用①

谭仕廉 郭 乐 申元英 （大理大学基础医学院医学微生物学与免疫学教研室，大理671000）

黏膜屏障是由黏液层、上皮细胞层、参与构筑屏障的蛋白以及免疫活性物质等组成，是阻止外界抗原如微生物、过敏原和致癌物等入侵黏膜组织的第一道防线，在维持黏膜免疫稳态方面具有重要作用。多种疾病都有黏膜屏障功能的破坏和黏膜炎症的发生，黏膜上皮细胞黏附连接和紧密连接的结构和通透性异常致使屏障功能受损，外界抗原通过受损的黏膜屏障进入机体，激活大量促炎症细胞，从而加重黏膜炎症反应。黏膜屏障功能受损导致黏膜炎症，黏膜炎症又进一步损伤屏障功能，两者互为因果，最终导致黏膜相关组织损伤性病变。

近年来研究表明，miRNAs 在黏膜屏障功能和黏膜炎症反应的调控中起重要作用。本文介绍了miRNAs 的生物功能，并探讨miRNAs 在调节黏膜屏障功能中的作用，此外还总结了多种miRNAs 在黏膜炎症中的表达变化及其在黏膜炎症性疾病中的调控作用。

1 miRNAs的生物功能

miRNAs 是进化上高度保守且广泛存在于真核生物中的一类非编码单链小RNA 分子，大小约为19~25 个核苷酸，与信使RNA（mRNA）结合抑制靶基因的表达或翻译来发挥转录后调控作用。1993年，AMBROS 和RUVKUN 研究组在秀丽隐杆线虫中发现了第一个 miRNA：lin-4［1］，7 年后发现了第一个哺乳动物 miRNA：let-7［2］，miRNAs 的发现彻底改变了分子生物学领域；随后研究证明miRNAs 可以调节细胞周期、分化、增殖以及死亡等关键过程［3］；筛选研究还显示miRNAs 具有组织和细胞特异性功能［4］。有研究显示，大约三分之二的人类基因是由转录后机制调控的，这一数据显示了miRNAs 在维持机体正常功能和调控人类疾病发生发展中起到至关重要的作用［5］。

迄今为止大多数研究表明，miRNAs 在其靶mRNA 的3'UTR 处与特定序列结合，从而诱导翻译抑制或 mRNA 的失活降解［6］。然而在 mRNA 其他区域，包括5'UTR 和编码序列以及启动子区域，也发现了miRNAs 结合位点［7-8］。在一定条件下，miRNAs还可能激活翻译或调节转录［9-10］。miRNAs与其靶基因的相互作用是动态的，并且依赖许多因素，如miRNAs 的亚细胞位置、miRNAs 与靶 mRNA 的丰度以及 miRNA-mRNA 相互作用的亲和性［11］。miRNAs还可被分泌到细胞外液中，并通过小泡（如外泌体）或与蛋白质结合运输到靶细胞，作为化学信使来介导细胞间的通讯［12］。

大部分miRNAs的形成是由DNA序列转录为初级 miRNA（pri-miRNA），加工为前体 miRNA（premiRNA），最终形成成熟miRNAs。目前已鉴定出的人类成熟 miRNAs 序列超过 2 500 个［13］。miRNAs 本身的表达调控机制是复杂而严格的，其生物形成过程中的任何中断或偏差都可能改变miRNAs 表达，并因此改变基因表达。最近一项研究显示Drosha、Exportin-5 和 Dicer 在 miRNAs 生物形成中不可或缺［14］，另一项研究表明 Argonaute 蛋白在转录后提高成熟miRNAs 的表达，降低miRNAs 降解，增加了miRNAs 的半衰期［15］。此外，有研究发现经典转录因子也参与调控miRNAs，以组织或发育特异性的方式调控其表达［16］。由于miRNAs 在生理和病理过程如炎症中的重要性，因此深入理解miRNAs 的表达调节是至关重要的。

2 miRNAs在调节黏膜屏障功能中的作用

黏膜表面通常与不计其数的外来物质相接触，包括食物、共生菌、病原体、过敏原、致癌物等。临床研究显示95%以上感染皆发生于黏膜，因此维持正常黏膜屏障功能在抵御外界抗原感染中具有重要意义。

许多研究表明，miRNAs 对维持黏膜完整性至关重要。例如，Dicer1 酶基因缺失的小鼠表现出肠上皮组织紊乱、上皮细胞非正常凋亡增加并出现黏膜的缺失［17］。miRNAs 对于正常黏膜上皮细胞的发育和增殖不可或缺。已知成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）是调控形成肺分支形态和上皮细胞增殖的关键信号，其受体是酪氨酸激酶信号之一，miR-let-7a靶向结合位于酪氨酸激酶信号转导下游的Ras 蛋白的mRNA，抑制Ras 蛋白表达，从而调控肺上皮细胞增殖［18］。此外，LU 等［19］发现miR-17-92 可靶向调节肿瘤抑制基因Rbl2 的表达，促进肺上皮祖细胞的增殖并抑制其分化，miR-17-92 簇缺陷的小鼠表现出肺发育不全，室间隔缺损以及B 细胞发育异常，实验小鼠出现异常的肺黏膜表型。

除了黏膜完整性，miRNAs 还参与调控黏膜屏障功能。上皮细胞之间的紧密连接是构成黏膜屏障的重要组成部分［20］，YANG 等［21］观察到炎症性肠病患者肠道黏膜组织和外周血miR-21明显升高，升高的miR-21 作用于其目的基因RhoB mRNA，使RhoB 表达明显减少，RhoB 与肠道通透性密切相关，RhoB 表达减少可导致肠道黏膜组织和体外培养细胞的紧密连接蛋白occludin 和ZO-1 明显减少，从而破坏上皮屏障。miR-122a 是另一种参与调控肠上皮紧密连接的miRNA，通过直接诱导紧密连接蛋白occludin mRNA 降解，导致肠上皮细胞中occludin 减少，TNF-α诱导的肠上皮通透性增加，该研究提示了靶向降低miR-122a 以保护肠道屏障的可行性［22］。此外，有研究表明，miR-495 靶向下调STAT3 的表达，抑制JAK-STAT3 炎性信号通路激活，从而改善了小鼠的肠黏膜屏障功能［23］。

3 miRNAs在调节黏膜炎症反应中的作用

3.1 miRNAs 在急性肺损伤中的作用 急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的特征是肺内严重炎症，肺泡-毛细血管膜完整性和肺黏膜屏障破坏，导致大量中性粒细胞和其他炎症细胞流入肺泡，释放炎症和细胞毒性介质，肺泡内充满富含蛋白质的液体，表面活性物质的合成和代谢受损以及局部促凝状态，因此，抑制炎性反应可能是ALI治疗的关键［24］。

许多学者证明了不同的miRNAs 在调控ALI 炎症中发挥的作用。WANG 等［25］发现 miR-155 在小鼠ALI 时表达增加，并通过负调控巨噬细胞中SOCS-1蛋白的表达，促进炎症细胞因子TNF-α、IL-6 的释放，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ALI小鼠模型中发挥促炎作用。在另一项研究中，miR-34b-5也被发现在肺损伤期间表达上调，miR-34b-5p抑制减弱了肺通透性、炎症细胞浸润和细胞因子水平，且靶向上调生长因子proanulin（PGRN）表达，促进创面愈合和减少细胞凋亡，进而在LPS 诱导的ALI 中发挥保护作用，这一研究提示了miR-34b-5p参与调控ALI的病程发展［26］。

ZHU 等［27］在 LPS 诱导的 ALI 大鼠模型中发现miR-21 的表达显著升高，Nuclear factor-κB（NF-κB）是炎性过程中关键性的核转录因子，在ALI 的早期阶段促进活化的巨噬细胞分泌产生各种促炎细胞因子。体外实验显示miR-21 会阻碍巨噬细胞中TLR4-NF-κB通路的激活，从而负向调节LPS诱导的炎症反应。同样的，SHI 等［28］观察到 miR-21 在Ⅱ型肺泡上皮细胞（typeⅡalveolar epithelial cells，AECⅡ）内高表达，且在细胞凋亡过程中明显下调。研究发现细胞内过表达miR-21-5p 可上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，同时下调促凋亡蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3（caspase-3）和 Bax 表达，减少 AECⅡ凋亡，从而减轻高氧性急性肺损伤。这些研究均证明了miR-21 在ALI 损伤中发挥保护作用。TLR4是LPS 的模式识别受体，在ALI 的动物模型和体外细胞模型炎症反应的上调和炎症细胞因子的释放中起着非常重要的作用。JU 等［29］研究显示miR-27a靶向负调控TLR4 蛋白水平，抑制TLR4-MyD88-NF-κB 通路激活，减弱LPS 诱导的小鼠巨噬细胞凋亡和炎症反应。同样的，YANG 等［30］研究显示在 LPS 诱导的肺泡上皮细胞中，miR-16 与 TLR4 的 3'UTR 相互作用，下调TLR4-NF-κB 通路，抑制下游NLRP3炎症小体激活，从而发挥改善炎症的作用。

近年来有研究发现，miRNAs 可以在细胞间转移并介导关键效应细胞间的通讯，进而在ALI 炎症中发挥作用。miR-223 因其在肺部炎症过程中介导肺浸润性多形核中性粒细胞（polymor-phonuclear neutrophils，PMNs）和肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AECs）之间的信号，受到 NEUDECKER等［31］的关注，进一步研究发现，miR-223 在 PMNs 中选择性升高并在转移到AECs 后靶向抑制PARP-1的表达，下调炎症因子的释放，从而起到缓解炎症的作用。miRNAs 还可以通过外泌体分泌的方式从供体细胞转移到受体组织，从而调节它们的生物学行为。在 WU 等［32］研究中，内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPCs）释放的外泌体中的 miR-126 转移到内皮细胞（endothelial cells，ECs），靶向下调SPRED-1 表达，部分增强了RAF-ERK 信号通路，可以有效改善大鼠的肺损伤，恢复肺毛细血管的完整性，减少肺部炎症和水肿的形成。在另一项研究中，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分泌的外泌体中miR-30b-3p 转移到AECs 后，直接靶向抑制血清淀粉样蛋白A3（serum amyloid A3，SAA3）的表达参与 ALI［33］。总之，miRNAs 在细胞间直接传递或通过外泌体转移的方式在受体组织中发挥作用，将为ALI的治疗提供新的视角。

3.2 miRNAs 在炎症性肠病中的作用 炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一组累及胃肠道的慢性、复发性、非特异性炎症性疾病。外界的各种刺激因素均可导致肠道黏膜屏障的完整性受损和通透性增加，使得病原菌易于穿过黏膜上皮屏障，造成黏膜固有免疫细胞和效应T 细胞的异常活化，炎症因子的大量产生以及免疫耐受机制的打破，最终导致肠道炎症的发生［34］。为了更具体地研究miRNAs 在调控IBD 发生发展中发挥的作用，一些研究确定了肠黏膜中功能性的miRNAs。ROJASFERIA［35］团队筛选比较了活动性克罗恩病（Crohn's disease，CD）和健康对照者结肠黏膜中miRNAs 的表达差异，分析显示 4 个miRNAs（miR-144、miR-211、miR-373-3p 和miR-519）在炎症的黏膜中显著上升，提示miRNAs 谱可作为活动性CD 的生物标志物。另外有研究也致力于比较溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和 CD 中 miRNAs 的表达差异，利用微阵列 分 析 提 示 miRNAs（miR-19a、miR-21、miR-31、miR-101、miR-146a 和 miR-375）可作为识别和区分CD和UC的标志物［36］。

肠黏膜局部T细胞在黏膜炎症反应中有重要作用，miRNAs 可以通过调控黏膜组织中T 细胞的成熟、分化、活化或其产生的细胞因子来影响黏膜炎症的发生发展。YANG 等［37］研究发现 IBD 患者结肠黏膜中高表达的miR-425 通过下调靶基因Foxo1 导致Th17 细胞分化增加，活化后的Th17 细胞又产生多种细胞因子（IL-17、IL-12、IL-21等）、趋化因子、基质金属蛋白酶等参与黏膜炎性反应，从而加重TNBS 诱导的小鼠结肠炎。miR-125a 在IBD 患者肠道黏膜和外周血单个核细胞中低表达，主要表达于CD4+T 细胞。E26 转化特异性-1（E26 transformationspecific 1，ETS-1）在Th1 细胞分化中是一个重要的靶点，在miR-125a-/-小鼠中，ETS-1 表达上调。实验表明miR-125a 是通过抑制ETS-1 的表达，从而抑制CD4+T 细胞向Th1 细胞的分化，在TNBS 诱导的小鼠肠道黏膜炎症中起保护作用［38］。CHAO 等［39］观察到IBD 患者外周血调节性 T 细胞（Treg）中 miR-155 的升高，Foxp3+Treg细胞中特异性过表达miR-155的小鼠表现出自发的自身免疫和更严重的DSS诱导的肠道损伤，CTLA-4 是一种由T 细胞表达的共抑制分子，是一种重要的免疫调节因子和炎症抑制剂，体外实验表明miR-155的促炎效果是靶向抑制CTLA-4表达来介导的。SHI等［40］发现 CD 患者和 UC 患者黏膜组织中升高的miR-31 通过降低IL-25 在转录物和蛋白质的表达水平，增强Th2 反应的同时抑制了Th1 和Th17 的细胞因子反应。体内外实验均显示miR-31 抑制剂的治疗降低了抗原提呈细胞中IL-12和IL-23 的水平，并且伴随着结肠IL-25 的升高而改善了结肠炎症。miR-31还可以调控参与T细胞成熟和极化的细胞因子——胸腺间质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的表达，使其在UC中促进黏膜愈合和调节炎症中发挥作用，而UC 患者的淋巴细胞中表达增加的miR-31 直接靶向下调TSLP表达，加重破坏炎症黏膜屏障的完整性［41］。

miRNAs 还可以通过激活或抑制炎症信号通路来调控黏膜炎症反应。LIN 等［42］在活动性 CD 中观察到表达上调的miR-143 与自噬相关基因2B（autophagy-related gene 2B，ATG2B）表达呈负相关，增强的自噬体活性能有效减轻NF-κB 介导的炎症，而miR-143 靶向抑制 ATG2B 的表达，引起 NF-κB 通路异常激活，增加促炎细胞因子的水平，从而加重了CD 的炎症反应。同样，UC 患者炎症结肠组织中miR-193a-3p 的下调伴随着PepT1（一种摄取细菌产物的二/三肽转运体）的上调，抑制NF-κB 途径激活，减轻了 DSS 诱导的结肠炎［43］。GUO 等［44］研究显示，miR-7 靶向三叶因子家族3（trefoil factor family 3，TFF3）抑制PI3K-AKT 信号通路来调节结肠细胞的增殖和迁移。抑制miR-7表达促进杯状细胞分泌TFF3蛋白，恢复紧密连接蛋白表达和细胞骨架重排来降低肠道通透性，对TNBS诱导的IBD动物模型的肠黏膜损伤具有保护作用。

目前，在肠黏膜炎症相关的miRNAs 中，miR-146a 和miR-155 在调节炎症反应中发挥重要作用。研究显示miR-146a 在暴露于细菌LPS 和肽聚糖以及鞭毛蛋白后诱导其高表达，过表达的miR-146a 降低TNF 受体相关因子（TRAF）-6 和 IL-1 受体相关激酶（IRAK）-1 的表达，因此认为 miR-146a 在负反馈机制中起防止过度炎症的作用［45］。与之一致的是，在ANZOLA 等［46］研究中，促炎细胞因子诱导肠上皮细胞中miR-146a表达升高，过度表达的miR-146a又诱导免疫耐受，抑制细胞因子MCP-1 和GROα/IL-8对LPS 或IL-1β 的反应。然而有报道显示高表达的miR-146a 增加了小鼠对DSS 结肠炎的易感性，肠道内过表达的miR-146a 抑制肠屏障基因表达，还抑制固有层内Th17 细胞和Treg 细胞的数量，miR-146a-/-小鼠通过增强MyD88 信号的机制增强了肠道内的屏障功能［47］。总之，在肠黏膜炎症中，miR-146a 不仅调节免疫反应，而且还影响屏障功能，但miR-146a 到底发挥促炎还是抑炎的作用似乎还需要更多的研究。LI 等［48］发现 miR-155 在 UC 中是一种强有力的调节因子来调节巨噬细胞极化，其缺乏可导致巨噬细胞M1 型转变成M2 型，M2 在结肠中的优势可导致肠道免疫细胞增殖受抑制并抑制CD4+T细胞向Th1 和Th17 极化，从而影响IBD 的发生发展。现有研究提示了miRNAs 可以通过多种途径参与调控肠黏膜炎症的发生发展，深入研究miRNAs 在肠黏膜炎症中的调控机制有望为IBD靶向特异性治疗及改善预后等提供新的方向。

3.3 miRNAs 在其他黏膜炎症性疾病中的作用 除了肺和肠黏膜，miRNAs 对于其他部位的黏膜组织比如生殖道、口腔、皮肤黏膜的炎症反应中同样发挥重要作用。伤口愈合是恢复皮肤完整性的一个基本的生物过程，其包括四个连续而重叠的阶段：止血、炎症、增殖和组织重构，LI 等［49］在伤口愈合的炎症期和增殖期，发现miR-31在角质形成细胞中逐渐上调，并通过抑制其直接靶基因上皮膜蛋白1（epithelial membrane protein 1，emp1）促进细胞增殖、迁移以及再上皮化，缓解炎症促进皮肤创面愈合，加快恢复完整的皮肤屏障。与LI 结果一致的是，SHI 等［50］的小鼠研究结果证实了 miR-31 通过直接靶向RAS/MAPK 通路的负调控因子Rasa1、Spred1、Spred2 和 Spry4 激活 RAS/MAPK 信号，促进皮肤伤口愈合过程中的再上皮化，这为miR-31在皮肤创口愈合中的重要性提供了又一证据。口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种伴有基底角质形成细胞变性的慢性炎症性口腔黏膜疾病。miR-125b 通过PI3K/Ak/tmTOR 通路靶向负调控基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP-2）的表达，在OLP 疾病发展中抑制角质形成细胞增殖，促进角质形成细胞凋亡，降低细胞癌变的可能性，这一结果提示了miR-125b是OLP 的潜在治疗靶点［51］。ZHENG 等［52］在 OLP 患者的黏膜中发现骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和 CD44 高表达，OPN 通过CD44 抑制CD8+T 细胞的凋亡，而口腔黏膜miRNA-214 靶向CD44 参与了口腔扁平苔藓的发生发展。let-7c通过抑制LPS 诱导 NF-κB 通路激活，调节下游促炎细胞因子的释放，缓解上皮细胞的坏死和中性粒细胞的募集，从而减轻子宫内膜上皮的损伤，提示let-7c对LPS刺激的子宫内膜炎具有保护作用［53］。然而let-7c 作用的具体靶基因仍待阐明。同样的，YIN 等［54］的研究表明 miR-19a 靶向目标基因 TBK1减弱NF-κB信号通路的激活，减轻LPS诱导的炎症。因此认为miR-19a可能作为治疗子宫内膜炎的靶点。

4 总结与展望

本综述强调了miRNAs 在维持黏膜屏障功能和调节黏膜炎症过程中的作用，从体外和体内研究中揭示了miRNAs 在急性或慢性黏膜疾病中的调控机制。当前miRNAs 的研究发展迅速，获得了重要的研究进展，但miRNA 研究仍处于早期阶段，无论是在实验室研究还是面向临床应用时，许多现实问题和技术性瓶颈仍有待解决。例如：①miRNA 制备过程中数量和质量的不稳定性，不同部位不同方法提取所得到的 RNA 质量不同［55］；②每个 miRNA 可预测出成百上千个可能作用的靶基因，使得辨别miRNA靶点和验证 miRNA 生物功能颇具复杂性［56］；③miRNA 调节药物的特异性和失靶作用；④miRNA 治疗药物的剂量考虑；⑤miRNA 对药物个体化治疗差异的影响等等。

综上所述，miRNAs 在疾病调控中表现出巨大潜力，尽管miRNAs 治疗仍存有诸多局限，但未来的研究将揭示miRNAs 在调控疾病中的更多细节，使得miRNAs 有可能成为预防、检测、治疗、监控、诊断疾病以及判断疾病预后的靶点，并为临床药物相互作用提供新的思路。未来的研究挑战在于将这些知识转化为成功的临床治疗，使得miRNAs 治疗成为最具潜力的新医疗方案。