中药巴戟天中多糖含量的快速测定方法研究

苏明伟，张 蕾，陈语炘

(湖北第二师范学院 化学与生命科学学院，武汉 430205)

巴戟天属于茜草科植物，其根茎为我国传统名贵南药，亦可作为保健品食用，具有抗衰老、抗肿瘤、抗骨质疏松、增强记忆及增强免疫力等多种功效[1-2]，其炮制方法有巴戟肉、盐巴戟天、药汁制巴戟天和酒制巴戟天[3]。现代研究表明巴戟天含有糖类、蒽醌类、环烯醚萜类、有机酸类、氨基酸和甾醇类等多种成分[4-6]，其中多糖被认为是促进免疫功能、抗骨质疏松的活性物质[7-8]，是巴戟天检测的重要指标之一。巴戟天多糖的测定，目前尚未见国家标准或行业标准方法，文献报道的方法主要有苯酚硫酸分光光度法[9-11]和蒽酮硫酸分光光度法[12-13]，其中样品的制备通常采用烘干后粉碎的方式，预处理采用两步加热回流的方式提取多糖，操作繁琐、时间较长，不利于基层的推广。本文以盐巴戟天为研究对象，提出以液氮粉碎为制备方法，以超声提取为预处理手段，开发了一套快速测定巴戟天中多糖含量的方法，为企业监控产品质量、筛选优质产品提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

共10个批次盐巴戟天样品，其中4个批次由无限极中国有限公司(广东)提供，5个批次分别购置于安国市聚药堂药业有限公司(广东)、广西仙茱中药科技有限公司、康美药业股份有限公司(广东)、苏州市天灵中药饮片有限公司和四川新荷花中药饮片股份有限公司，1个批次由本课题组用巴戟天为原料自制，均为2017～2018年生产，分别编号为1～10号。

1.2 仪器及设备

TU-1950紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；SB-5200DT超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；KX-100高速粉碎机：武汉鼎藏日用金属制品厂；ME104E分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SHZ-D(III)循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；HH-4恒温水浴锅：金坛市新航仪器厂；QYZH-20A超纯水仪：重庆前沿水处理设备有限公司。

1.3 试剂与溶液的配制

葡萄糖标准品：阿拉丁工业公司(上海)；无水乙醇、苯酚、浓硫酸：均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

葡萄糖标准储备液(1.000mg·mL-1)：精密称取干燥后的葡萄糖标准品0.1000g，溶于少量水中并转移至100mL容量瓶中，加入0.5mL浓盐酸防止微生物生长，加水定容至刻度；葡萄糖标准使用液(0.1000 mg·mL-1)：将葡萄糖标准储备液稀释10倍，使用当天配制；苯酚溶液(5%)：将苯酚瓶置于60℃水浴中熔化，然后移取5.00g于烧杯中，加水溶解并转移至100mL容量瓶中定容摇匀。

1.4 样品的制备

取一定量(约50g)盐巴戟天样品于高速粉碎机中，加入30mL液氮，立即快速封盖并高速粉碎30s，打开拌匀后，重复加液氮再粉碎一次，装入具塞宽口瓶中备用。

1.5 多糖的提取

超声提取(本法)：精密称取0.50g样品粉末置于100mL锥形瓶中，加入70mL 80%乙醇溶液，60℃下超声提取30min，趁热过滤，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次8mL，弃去滤液。滤渣连同滤膜置于锥形瓶中，再加70mL纯水60℃超声提取30min，滤纸抽滤过滤，滤渣用热水洗涤3次，每次8mL，收集水提液并冷却定容至100mL，即得待测溶液。

加热回流提取(对照法)：精密称取0.50g样品粉末置于250 mL圆底烧瓶中，加入150mL 80%乙醇溶液，于90℃水浴中回流1h，趁热过滤，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10mL，弃去滤液。滤渣连同滤膜放回圆底烧瓶中，再加150mL纯水于90℃水浴中回流1h，滤纸抽滤过滤，滤渣用热水洗涤3次，每次10mL，收集水提液并冷却定容至250mL用来测定多糖含量。

1.6 标准曲线的绘制

分别吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL葡萄糖标准使用液于25mL比色管中，各加水至2.00mL，再各加5%苯酚溶液1.00mL，摇匀，再垂直快速加入浓硫酸5.00 mL，摇匀并放置5min，置40℃水浴中20min，取出冷却至室温，以试剂空白为参比，于490nm波长处测量吸光度。以葡萄糖浓度c(mg·mL-1)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线并拟合回归方程。

1.7 样品测定与结果计算

分别取上述1.5超声提取或加热回流提取的水提液1.00mL于25mL具塞比色管中，按1.6步骤测定吸光度，代入标准曲线方程并计算出样品中的多糖含量，以质量分数计(单位mg·g-1)，其中葡萄糖换算为多糖的换算因子为0.9。

2 结果与分析

2.1 测定波长的确定

吸取一定量葡萄糖标准使用液于具塞比色管中，按照1.6步骤显色，以试剂空白为参比于紫外可见分光光度计上扫描吸收曲线，结果见图1。由图1可知，显色生成物的最大吸收波长为490nm，因此确定以490nm为最佳测定波长。

图1 苯酚硫酸法测定葡萄糖的吸收曲线

2.2 标准曲线方程

按照1.6标准曲线的绘制步骤进行操作，以试剂空白为参比于490nm波长处测量吸光度并绘制标准曲线。可得苯酚硫酸法测定葡萄糖的回归方程为A=63.183c+0.0062，R=0.9998，可见在0～0.0125 mg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.3 样品的制备研究

常规的样品制备程序一般是先将巴戟天样品烘干 (限定60℃[14]) 后，再粉碎过筛(60目)。实验中发现该过程不仅非常费时，且样品粉末在过筛时非常容易吸收空气中的水分，会导致误差的出现。而中药企业在药材成品的常规检测过程中一般可以对药材中微量水分的影响忽略不计的，但若样品不经烘干直接粉碎，部分样品在粉碎时会因温度急剧升高而粘连在一起难以过筛，因此本研究拟不对样品进行烘干处理，尝试直接对原样进行加液氮粉碎处理并比较粉碎次数对多糖测定结果的影响。

具体操作参见1.4样品的制备，结果表明，加入液氮后样品的粉碎效果比较理想，粉碎后颗粒较均匀分散，温度较低不易粘连在一起，粉碎次数越多，颗粒越小越均匀。不同粉碎次数对多糖含量(超声提取检测)及水提液过滤时间的影响见图2所示，随着粉碎次数的增加，多糖测定值逐渐减小，但粉碎3次与2次的结果相差不大，而3次时颗粒很细导致后续水提液过滤比较困难，综合考虑最终确定样品加液氮粉碎2次30s为最佳制备方案。

图2 粉碎次数对多糖含量及水提液过滤时间的影响

2.4 超声提取条件的优化

超声萃取技术是近年来发展起来的一种新型分离技术，具有快速、安全、高效等特点，被广泛用于中药材提取的研究[15]。但目前超声用于巴戟天中多糖含量测定的研究鲜有报道，因此本研究尝试用超声提取进行巴戟天样品的预处理。

实验首先比较了超声提取温度对多糖测定结果的影响，因超声仪水槽的最高设定水温为60℃，因此比较了20℃、40℃与60℃的影响，发现温度越高，多糖测定值越低，而60℃的结果更接近加热回流提取(对照法)的数值，其原因可能是较高温度下醇提更易去除单糖和低聚糖的干扰，因此确定超声提取的最佳温度为60℃.

在最佳温度下比较了两步(醇提+水提，参见1.5)超声提取时间对结果的影响，结果表明两步提取时间均为30 min或60min 时样品中多糖的检测结果没有明显差异，说明超声提取多糖的主要影响因素是温度而非提取时间，因此确定两步超声提取的最佳时间均为30 min。

2.5 超声提取与加热回流提取的比较

因巴戟天中多糖的测定(含预处理)没有国家标准方法可供参考，因此本研究采用文献报道较多的加热回流提取法作为对照法与超声提取法进行比较，试图找出超声提取与对照法的关联。

对10个样品进行液氮粉碎制备后分别采用上述最优超声提取法和加热回流提取法进行样品预处理并均用苯酚硫酸法测定多糖含量，重复测定三次，计算平均值和相对标准偏差，结果见表1所示。可见，总体上超声提取与加热回流提取的精密度之间差异不大，但相同样品的超声提取法测定结果明显高于加热回流法，这可能与两个方法的温度差异有关，也可能与超声的空化效应能快速破碎细胞壁有关。同一提取方法测得不同厂家样品的多糖含量高低不同，其中5号样品多糖含量远高于其它样品，具体原因不详。

表1 超声提取与加热回流提取巴戟天中多糖的比较

续表1

将两种提取方法的多糖测定均值进行线性拟合，结果见图3所示，拟合公式为y=0.3321x+5.7767，x代表超声提取测定结果，y代表加热回流提取结果，R2=0.6797，线性相关系数R=0.8244，说明两种提取方法之间有比较明显的相关性。

图3 超声提取结果与加热回流提取结果的拟合

若将超声提取测定值用拟合公式换算成加热回流对应值，并以加热回流提取的实验值为标准值计算相对误差，具体结果见表2。由表2可知，10个不同样品的超声提取测定值经换算后，与加热回流法测定值的相对误差均小于10%，准确度上满足快速检测的要求。

3 结论

本文以盐巴戟天为研究对象，建立了一套快速测定巴戟天中多糖的方法，首次将液氮粉碎和超声提取用于巴戟天的检测过程，实现了从制备到提取到检测过程的快速化。本法操作简便、快速，单个样品测定时间约为3h，相对于传统的样品烘干粉碎-加热回流提取-苯酚硫酸法检测过程(约需12h)，时间上缩减了约3/4，且一台超声仪可以同时提取6个样品，大大提高了工作效率，适用于企业大批量检测筛选优质产品。本法精密度好，结果可靠，其多糖测定结果可以直接作为企业的产品质量依据，也可以通过拟合公式换算为传统的加热回流提取法的对应结果。

表2 超声提取换算结果与加热回流提取结果的比较