年龄相关性白内障患者氧化损伤修复基因表观遗传学研究进展△

李鹏飞 张国伟 曹宇 陈晓娟 王莹 管怀进

白内障是世界首位致盲性眼病，其中年龄相关性白内障(ARC)是最常见的类型。目前，通过手术摘出混浊的晶状体并植入人工晶状体是治疗ARC的唯一有效方法[1]。迄今为止，ARC的病因和发病机制仍不明确，而年龄、性别、吸烟、紫外线辐射、遗传易感和环境因素均可影响ARC的疾病进展[2-3]。氧化损伤主要引起DNA损伤，是目前较为公认的ARC发病机制，晶状体上皮细胞(LECs)DNA氧化损伤修复能力的不足对ARC发生发展具有重要作用[4]。因此，研究DNA氧化损伤修复基因的上游调控机制至关重要。近几年来表观遗传学研究发展迅速，许多研究聚焦ARC形成过程中氧化损伤修复基因的表观遗传改变[5-7]。本文通过回顾氧化损伤修复基因的表观遗传修饰在ARC的研究进展，同时揭示表观遗传学在ARC发生发展中的作用，以期为ARC的机制研究提供新思路，为ARC患者创造更大的受益价值。

表观遗传学指在DNA核苷酸序列不发生改变的情况下，基因的表达发生了可遗传的改变,进而导致表型变异的遗传现象及本质。其研究内容主要包含DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等多种修饰方式，是通过不同的修饰组合共同调控基因的特异性表达，从而影响其功能和特性[8]。研究发现，表观遗传学与许多眼部疾病密切相关，如青光眼[9-10]、年龄相关性黄斑变性[11]和视网膜母细胞瘤[12]等眼科疾病，同样也参与了ARC的形成过程。

1 DNA甲基化与氧化损伤修复基因

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，以S腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位和该甲基基团共价结合的过程。CpG二核苷酸是DNA甲基化的主要位点，人类的CpG以2种形式存在，一种是分散于DNA重复序列区域中的CpG，这些CpG位点在健康人基因组中通常是甲基化的，以维持染色体的稳定性；另一种是成簇聚集在基因启动子区域的CpG，称为CpG岛。人类基因组中约60%的启动子区含有CpG岛。正常情况下，CpG岛中的CpG位点常处于非甲基化状态，以维持转录活性，确保基因的正常表达。因此，CpG岛的高甲基化状态与基因沉默有关，而去甲基化则与基因活化有关[13-14]。

本课题组前期利用DNA氧化损伤修复基因芯片板检测了92个DNA氧化损伤修复基因在ARC及对照晶状体前囊膜上皮细胞中的表达[6]。结果发现：在这92个基因中，有11个基因在2组间存在明显的差异性表达，其中10个基因在ARC中表达较低，1个基因表达较高。为了深入探讨差异表达基因调控的确切机制，我们对这11个基因的启动子区进行DNA甲基化分析，发现在ARC中，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)基因启动子呈高度甲基化，并且与该基因在ARC中的低表达有相关性。扩大患者样本验证后，MGMT的启动子区仍呈高甲基化，猜测MGMT的高甲基化通过影响该基因的表达，而促进ARC的发生[6]。其他差异表达的DNA修复基因如X射线修复交叉互补蛋白6(X-Ray repair cross complementing 6，XRCC6)等，在2组间的甲基化率无显著差异。我们前期只是在部分氧化损伤修复基因中筛选表达与DNA甲基化相关联的基因，并未进一步研究其调控机制。

作者所在团队还发现氧化损伤修复基因切除修复交叉互补组6(excision repair cross-complementation group 6，ERCC6)基因在ARC患者LECs中的表达明显下调，并且在ERCC6启动子区存在一个长度为207 bp的CpG岛(-603 ～ -396，转录起始位点+1:chr10:49540952)，而该区域也是转录因子Sp1的预测结合位点。随后，我们在60个样本(30个对照和30个ARC患者)中进行验证，证实了位于ERCC6启动子区的12个CpG位点发生高度甲基化。研究发现ERCC6在2组(对照组和ARC组)中的表达减少与启动子区CpG位点8 (-441)的高甲基化状态相关。我们进一步研究发现，经UVB照射后，DNMT3b与ERCC6启动子区的结合变强，使此位点的CpG高甲基化。同时，CHIP实验证明在ARC中，转录因子Sp1通过其特异性结合位点与ERCC6启动子区结合减弱。该研究表明，ERCC6的转录在ARC中可能受表观遗传学的调控，从而导致DNA氧化损伤修复过程受阻[7]。

此外，本课题组通过DNA修复基因芯片板研究了健康人和ARC患者的晶状体皮质中DNA氧化损伤修复基因的表达变化，结果发现基因表达改变模式不同于LECs，其中OGGl基因表达在ARC患者晶状体皮质中明显下调[5]。在该基因的第1外显子中，存在1个CpG岛的15个CpG位点明显高甲基化，这与OGG1的低表达显著相关；使用去甲基化药物5-氮杂-2脱氧胞苷(5-aza-2’deoxycytidine，5-aza-dC)处理LECs细胞株(HLEB3)后，该基因表达恢复；使用小干扰RNA技术沉默该基因表达后发现，经UVB照射后的HLEB3凋亡明显增加。以上实验证明OGGl基因表达受DNA甲基化调控，并与ARC的发生有一定的相关性。

作者所在团队后期研究发现，DNA氧化损伤修复基因沃纳解旋酶基因(Werner helicase genes，WRN)在皮质性、核性和后囊下白内障前囊膜和皮质中均低表达。此外，在ARC患者前囊膜组织晶状体上皮细胞中，该基因启动子区甲基化明显高于正常对照，其主要原因是由于在该基因组蛋白H3-K9(组蛋白H3中的第9位赖氨酸)出现高甲基化，而在晶状体皮质中却没有差异[15]。

2 组蛋白乙酰化修饰与氧化损伤修复基因

组蛋白是指在所有真核生物的细胞核中,协助DNA包装形成核小体的一类碱性蛋白质的总称。组蛋白有2个活性末端：羧基端与氨基端。其中由核心组蛋白的氨基酸残基组成的N端尾突出于核小体之外，是组蛋白修饰的主要区域。常见的组蛋白翻译后修饰包括：乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和类泛素化等[16]。乙酰化是最重要的组蛋白修饰。乙酰基转移酶(histone acetyltransferase，HAT)催化的乙酰化和组蛋白去乙酰化酶( histone deacety1ase，HDAC)催化的去乙酰化共同维持了组蛋白乙酰化水平的动态平衡。HAT对核心组蛋白H3和H4的乙酰化修饰可以消除赖氨酸残基的正电荷，直接影响核小体的结构，并为其他蛋白提供了DNA结合位点，从而降低染色质的稳定性，活化基因转录[17]；相反，去乙酰化是通过HDAC抑制基因的转录，使得两者维持可逆的动态平衡[18]。

谷胱甘肽S-转移酶M3(glutathione S-transferase Mu 3，GSTM3)是谷胱甘肽结合反应的关键酶，具有较强的抗氧化功能。我们通过在2种晶状体上皮细胞株中进行验证发现：GSTM3表达水平在HLEB3细胞中较SRA01/04细胞低，其启动子甲基化改变不明显。进一步研究发现其在HLEB3细胞的H3乙酰化水平较低，而H3-K9处的甲基化水平较高。使用DNA甲基转移酶抑制剂或组蛋白去乙酰化酶抑制剂后，HLEB3细胞中的GSTM3表达均增加，因此GSTM3的表达可能受晶状体组织中表观遗传改变的调控。GSTM3启动子的高甲基化和组蛋白修饰的改变可能参与了ARC的形成[19]。此外，我们还发现在UVB照射后，ERCC6启动子区附近的HDAC1显著增加，导致该区域组蛋白H3-K9的去乙酰化增强，从而抑制ERCC6的转录[7]。本课题组的研究结果为控制ARC表观遗传变化提供了一种潜在的治疗策略。这些结论除了证明晶状体DNA损伤修复能力的改变与ARC发病机制有关之外，也将表观遗传改变与目标基因表达联系在一起，并且与当前的表观遗传学对人类基因组影响的知识相一致。遗憾的是，我们目前的研究均局限于体外细胞株，进一步探索还需要大量的动物体内实验进行验证。关于去甲基化药物和HDAC抑制剂在动物体内实验中具体给药方式(如前房给药或局部药物滴眼)以及这些药物对眼内其他正常细胞的毒性作用等仍待解决。

3 ncRNA与氧化损伤修复基因

非编码RNA(ncRNA)是一类内源性、不编码蛋白的RNA。非编码RNA主要包括微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)以及与以上线性结构不同的环状RNA(circRNA)等。虽然ncRNAs不能翻译成蛋白质，但越来越多的证据表明，miRNA、lncRNA和circRNA参与基因的表达调控。 MiRNA的作用机制是与其靶基因信使RNA(mRNA)的3’非翻译区(3’UTR)结合后，介导mRNA的降解或转录后水平的基因沉默[17]。lncRNA广泛存在于生物体内，可以通过调控基因的表达方式影响细胞增殖、凋亡、活力、免疫反应和氧化应激[20]。circRNA是一类新型的非编码RNA，由剪接小体通过反向剪接产生，再将外显子的3’端与上游外显子的5’端共价连接[21-22]。大多数circRNA来源于蛋白质编码基因，包含完整的外显子。circRNA主要通过miRNA海绵作用或RNA结合蛋白调控靶基因[23]。

lncRNA、circRNA和miRNA之间的相关性提示在多种疾病中存在复杂的表观遗传调控机制[24]。我们前期研究发现，DNA氧化损伤修复基因的表达可以通过ncRNA进行调控[4,24]。本课题组分别提取了6例ARC患者晶状体前囊膜和6例年龄匹配的透明晶状体前囊膜中的总RNA，使用高通量测序分析lncRNA表达谱[24]。结果发现，在ARC组有182个lncRNA下调和49个lncRNA上调。经PCR验证，我们选择了显著上调的lncRNA H19。实验检测发现其靶基因胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine DNA glycosylase,TDG)在ARC患者中表达显著降低。该基因在DNA氧化损伤碱基切除修复(base excision repair，BER)途径中起重要作用。另外，有研究发现，TDG能够保护DNA免受氧化、脱氨以及构象改变的影响，并参与Wnt信号通路调控细胞的凋亡和增殖[25-26]。沉默lncRNA H19发现加重了SRA01/04细胞的氧化损伤，而过表达lncRNA H19则减轻了SRA01/04细胞的氧化损伤。深入研究发现，在LECs中lncRNA H19通过与miR-29a竞争性结合来上调TDG的表达[24]。这些数据表明，lncRNA H19在ARC早期通过协同miRNA一起调节氧化损伤修复通路。所以lncRNA H19/miR-29a/TDG轴的氧化损伤修复途径可能是治疗ARC的潜在靶点。

已有文献报道磷脂酶C(phospholipase C,PLC)在心肌氧化损伤中起保护作用[27]。我们研究发现，PLCD3的lncRNA(PLCD3-OT1)在ARC的LECs中变化最为明显，并且后期实验证实了PLCD3在LECs的氧化损伤中的保护作用。PLCD3-OT1作为一种内源性竞争性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，在ARC中发挥海绵效应，通过吸附miR-224-5p来调控PLCD3的表达[4]。此外，lncRNA GPX3-as通过直接促进谷胱甘肽过氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPX3)的表达而减少了LECs的凋亡[28]。lncRNA和miRNA之间的相互联系提示在ARC中存在复杂的调控机制。

一些学者研究发现，有几种miRNA在晶状体中特异表达，这对于影响调节ARC发生发展中发挥重要作用，如let - 7b、miR - 34a、miRNA -125b、hsa-miR-3912-5p、miR-421、miR-24-p53和miR-193a[29-30]。此外，也有学者将circRNA与miRNA之间的协同调控机制进行了拓展。Liu等[31]通过circRNA测序发现，在透明晶状体和ARC晶状体中，有101个circRNAs存在差异表达，其中75个circRNAs表达下调，26个circRNAs表达上调。研究发现，circHIPK3在ARC不同分型(皮质型、核型和后囊下型)的晶状体组织中均显著下调。沉默circHIPK3可以明显加速氧化应激后的细胞凋亡，这表明ARC患者circHIPK3水平的降低促进了氧化应激下LECs的凋亡，导致ARC的形成和发展。进一步研究表明，对于维持晶状体透明起重要作用的α-晶状体蛋白(alpha A crystallin，CRYAA)是miR-193a的直接靶标，低表达的circHIPK3吸附miR-193a能力减弱使得CRYAA表达减少，因此减弱了CRYAA作为分子伴侣的保护作用，促进LECs凋亡[28]。该研究表明了晶状体中重要的结构蛋白CRYAA存在circRNA和miRNA复杂的协同调控机制，但未能研究其在ARC氧化损伤修复修复基因中的作用机制。综上所述，ncRNAs参与ARC中表观遗传修饰的建立，并提示ncRNA在细胞水平和个体水平表观遗传信息的传递过程中可能起重要作用。

4 总结与展望

表观遗传调控作为基因特异性表达的重要调控机制，在ARC中对调控DNA氧化损伤修复基因的表达发挥重要作用。表观遗传中3种主要机制：DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA。三者均参与了DNA氧化损伤修复基因的调节。尽管近年来表观遗传学参与ARC发病机制的研究逐渐增多，但其复杂多样性以及进展迅速让各种研究进展举步维艰，也是亟须解决的重大问题。如近期较为热门的RNA甲基化，亦属表观遗传学的一个分支，其也可能参与ARC的疾病进展。这为表观遗传学与ARC的研究提供一个新的方向。由于表观遗传的改变是可逆的，应用表观遗传学的手段，如DNA甲基化抑制剂、HDAC抑制剂以及调控miRNAs表达水平的靶向抑制剂等可能会成为未来ARC治疗的新方向，为ARC患者带来福音。