艰难梭菌感染与肠道微生态的研究进展

王晓亚，安彦波，戴敏高，赵丽娜，刘军肖，牛占丛

1 艰难梭菌与肠道微生态概述

艰难梭菌(Clostridiumdifficile)是一种严格厌氧的革兰阳性芽孢杆菌[1]，但它可以在有氧环境中存活。艰难梭菌定植于3%的健康成人和近80%的健康新生儿及婴儿的肠道中，它属于条件致病菌, 正常肠道菌群可以抵抗艰难梭菌的定殖和过度生长，而在长期大量使用抗生素的患者或其他免疫力低下的人群中，艰难梭菌会过度增殖并释放毒素，引起以肠道病理损伤为主的感染性疾病，即艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection,CDI)[2]。艰难梭菌是引起抗生素相关腹泻的最主要病原菌，可引起一系列疾病，如腹泻、暴发性结肠炎、假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、肠穿孔、脓毒症和多器官功能障碍，是医院内获得性细菌感染及胃肠炎症相关死因的首要原因，严重威胁住院患者的健康[3-4]，据报道，艰难梭菌感染病死率可高达6.9%～16.7%[5]。高毒力的艰难梭菌菌株(BI/NAP1/027型)[6]进一步加剧了这一问题，使得艰难梭菌感染引起了更多的关注,该型菌株可引起暴发型结肠炎，病情进展迅速，病死率高，预后差。在过去的十年中，由于与艰难梭菌感染相关的发病率、死亡率和医疗费用的增加，艰难梭菌受到了新的关注[7]。

肠道微生态包含肠道微生物及其代谢产物。人体内的微生物数量至少和人体细胞的数量一样多[8]，这些微生物可存在于人体所有的粘膜部位。肠道是微生物数量最丰富的器官，由1 000多个不同的细菌种类组成，其编码的基因数量是人体自身基因数量的数百倍，肠道菌群的总质量可达1.5 kg[9-10]。肠道微生物分布广泛、数量庞大，人体肠道内定居着约一百万亿个微生物，并且其基因组含有参与胆汁酸代谢、碳水化合物发酵、氨基酸代谢等基因，在人体作用机制复杂，参与人体的多种生理及病理过程。肠道微生物与多种代谢、内分泌、自身免疫和炎症性疾病有关，并参与物质代谢和营养合成[9-13]。了解肠道微生态的改变与艰难梭菌之间的联系有望确定新的治疗策略和生物标志物，从而预测治疗结果并提高诊断水平。

2 艰难梭菌致病机制

艰难梭菌在人体肠道内定植主要分为产毒型菌株和非产毒型菌株，而产生致病作用的主要是产毒型菌株。艰难梭菌在肠道内增殖并分泌毒素A(toxin A,TcdA)和毒素B(toxin B,TcdB)两种毒素，TcdA是一种肠毒素，也有一定的细胞毒性作用，TcdB是一种细胞毒素，毒素B的毒力较毒素A强10倍[14-16]，毒素激活肠道宿主免疫，使中性粒细胞增加，并产生杀菌活性氧中间体、防御素、促炎细胞因子和趋化因子[17]，导致强烈的炎症反应。这些毒素还通过多种通路与肠道上皮细胞表面受体结合，转运到胞浆，然后修饰Rho、Ras和Rap亚家族的小分子GTP酶，通过这一作用破坏肠道上皮肌动蛋白骨架和紧密连接[18]，使真核细胞骨架崩溃，并对肠上皮细胞产生细胞毒作用，引起结肠炎症等一系列病变。有些毒株还会产生由染色体上致病性决定区外的基因cdt A、cdt B编码的二元毒素[19]，从而使艰难梭菌毒力进一步增强。CDI 发病率和严重程度的增加在很大程度上归因于一种新的艰难梭菌毒株的出现，即 BI/NAP1/027[20]，该菌株中TcdA和TcdB的产生增加，存在二元毒素，同时发现一种重要毒素产生下调基因 tcd C的缺失，可能有助于艰难梭菌毒性增加[6]。

肠道微生态紊乱是艰难梭菌致病的另一个潜在因素。肠道微生态紊乱可能通过胆汁酸代谢、氨基酸代谢、碳水化合物发酵物等代谢物来增加艰难梭菌的致病性。肠道微生物对膳食纤维进行厌氧发酵会产生短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)，当SCFAs浓度下降时，pH升高，从而产生有利于艰难梭菌生长的环境[21]。初级胆汁酸可以促使艰难梭菌芽孢萌发[22]。另外一些研究表明，艰难梭菌的非毒素分子，特别是S层蛋白 (S-layer protein, SLP)，具有免疫调节作用。研究表明艰难梭菌外蛋白质组组成与艰难梭菌基因型相关，某些菌株分泌的特定蛋白质可能与TcdA和TcdB的毒力增效有协同作用，生化分析表明，一种基因型为ST54_NAPCR1的菌株分泌的S层蛋白A(S-layer proteinA, SlpA)比其他菌株多，此外，ST54_NAPCR1菌株的SLpA具有较强的促炎活性[23-24]。

3 艰难梭菌感染的高危因素

多种危险因素可以导致CDI，关于CDI的危险因素的研究日益增多，但结论不尽相同，主要包括长时间住院、年龄大于65岁、免疫功能低下、使用抗生素治疗和应用质子泵抑制剂等[23,25]。CDI的危险因素与肠道微生态的改变有关。

3.1 抗生素 艰难梭菌感染通常与抗生素引起的正常肠道微生物区系多样性丧失有关。正常情况下，肠道微生态在维持健康人体新陈代谢，免疫防御方面起重要作用[26]。引起艰难梭菌感染的抗生素，几乎涵盖了所有的种类，尤以第三代头孢菌素、广谱青霉素、碳青霉烯类等广谱抗生素居多[27-29]。同时，CDI 的发生风险取决于抗生素使用的频率、持续时间、抗生素的给药方式和使用药物的剂型[30]。不同种抗生素产生了独特的肠道微生物群落，增加一些促进艰难梭菌生长底物的浓度，例如初级胆汁酸以及生长所需的甘露醇、果糖、山梨醇、棉子糖和水苏糖等碳源使艰难梭菌得以定植[22, 31-32]。与健康人相比，接受抗生素治疗的人的肠道微生物态显示出微生物多样性、均匀性和丰富度降低。抗生素会改变肠道菌群的组成，包括肠杆菌科丰度增加和毛螺菌科、瘤胃球菌科、双歧杆菌丰度的降低，影响微生物代谢，使艰难梭菌等增加[33]。另外，抗生素的使用会改变微生物的结构和胆汁酸的代谢，进一步启动艰难梭菌芽孢的萌发。此外，免疫系统和肠道微生物群之间信号通路的改变也可能导致抗生素暴露后对CDI的易感性增加。

3.2 年龄 肠道正常菌群是一种重要的天然防御机制，可抑制艰难梭菌的生长。多项临床数据分析提示年龄是CDI的独立危险因素[34-35]。老年人常合并基础疾病、既往抗菌药物史、自身免疫力和抵抗力降低等，故抵抗 CDI 的能力也明显下降。年龄大于65岁的老年人，尤其是既往长期住院或长期处于疗养院等医疗机构的老年人应该高度警惕CDI的发生。

3.3 质子泵抑制剂 使用药物(质子泵抑制剂，PPIs)抑制胃酸的产生也会增加艰难梭菌感染的风险。PPIs可以抑制胃酸的分泌，导致胃内pH升高、胃酸保护屏障破坏，引起胃肠道系统的各类不良反应，更加有利于艰难梭菌的定植。多系统评价表明,PPI的大量使用可以引起肠道微生态紊乱，诱发艰难梭菌感染[27, 36-37]。并且研究表明CDI的风险具有剂量依赖性[37]。因此，临床上应该注意PPIs的适应症和使用剂量，以降低CDI风险。

4 肠道微生态的定植抗性

肠道微生态失调会导致机体抵抗艰难梭菌感染的屏障被破坏，同时艰难梭菌感染也会导致肠道微生态紊乱，进而使肠道屏障功能下降甚至丧失，在肠道菌群被抑制的人群中细菌很容易定居并繁殖成为优势菌群。肠道菌群主要分为4个菌门:厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，健康的肠道微生物群主要以厚壁菌门及拟杆菌门为优势菌门。艰难梭菌感染等因素可以破坏宿主肠道屏障和肠道菌群结构，尤其是降低厚壁菌门和拟杆菌门的丰度。基因组分析显示，艰难梭菌感染后肠道微生态发生改变，表现为物种多样性和丰富度显著下降，主要是拟杆菌门的拟杆菌科和厚壁菌门(Firmicutes)的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)减少[38]。肠道中可用于艰难梭菌萌发和生长的代谢物，主要受到厚壁菌门和拟杆菌门两个优势门的强烈影响[22]。

肠道微生态的平衡和稳态有助于宿主抵抗细菌、病毒和真菌感染，即定植抗性。肠道微生态定植抗性的机制主要包括以下4个方面。一是肠道菌群与病原体营养和空间竞争：细菌等病原体为了在肠道中定居，必须与高度适应肠道环境的肠道微生物群争夺相同的营养源。肠道微生物竞争性消耗和利用某些单糖等营养物质，从而抑制艰难梭菌等病原体的繁殖。二是肠道微生物分泌抑菌或杀菌的小分子从而抑制致病菌定植：肠道微生物群某些菌株可以产生和分泌具有抑菌或杀菌活性的小分子，如内源性抗菌肽类物质、细菌素和溶菌酶等[39]。当艰难梭菌进入人体后，肠道内的抗菌肽类物质发挥抗菌作用。但同时，一些病原菌也可以通过此种方式影响肠道菌群从而在肠道内定植。三是肠道微生物产生代谢产物抑制病原体的生长：如次级胆汁酸、SCFAs、氨基酸等代谢产物[40-42]。SCFAs可以通过影响细胞内的pH和代谢功能来抵抗病原菌的生长，且短链脂肪酸的浓度与肠道pH值呈负相关，另外，SCFAs等代谢副产物激活免疫反应，从而影响全身免疫应答[9]。琥珀酸是肠道微生物碳水化合物发酵产生的有机酸，是肠道中的一种重要中间代谢物，可促进体内艰难梭菌的感染[43-44]。在健康的肠道微生态中，初级胆汁酸鹅脱氧胆酸、次级胆汁酸脱氧胆酸和石胆酸能抑制艰难梭菌在大肠内的孢子萌发和生长。然而，抗生素的使用会改变微生物的结构和胆汁酸的代谢。一项在小鼠肠道进行抗生素诱导的实验表明，抗生素诱导后引起小鼠肠道微生物群和代谢组的改变，肠道内初级胆汁酸在肠道微生物产物作用下脱羟基转化为次级胆汁酸[45]，从而有利于艰难梭菌的生长，同时促进艰难梭菌孢子的萌发，增加了CDI的易感性。甘氨酸与某些胆汁酸结合可促进艰难梭菌的萌发。组氨酸含量的增加与艰难梭菌阳性的患者样本有关，此外，抗生素敏感小鼠盲肠内容物中N-乙酰化甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸增加，而N-乙酰化天冬氨酸减少[46]。四是肠道微生物可增强免疫应答抵抗病原菌定植：肠道微生物对于多种免疫细胞的发育和功能是必不可少的，肠道微生物群可以对肠道免疫细胞群产生局部和全身性影响，包括影响固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)和Th17(T helper 17 cells)产生细胞因子、调节性T细胞(Tregs)的分化、激活中性粒细胞、诱导IgG反应等[10, 47-48]。Chen等实验展示了由γδT细胞产生的IL-17A在抵抗艰难梭菌感染的宿主防御中的重要作用[49]。动物实验证实给小鼠直肠注射纯化蛋白SlpA可引起全身性和局部性体液免疫反应，产生IgG和IgA抗体，能减少艰难梭菌在小鼠肠道中定植[50]。

5 艰难梭菌感染的治疗

大多数的艰难梭菌感染是由使用抗菌药物后健康的肠道菌群紊乱引起的，CDI 治疗的首要原则是尽早停止目前正在使用的的抗菌药物，其次是口服有效治疗药物。目前临床上用于治疗 CDI 的药物主要包括甲硝唑、万古霉素、非达霉素等。CDI治疗的基石最近由甲硝唑和万古霉素改为万古霉素和非达霉素。

有研究表明益生菌在预防原发性CDI方面有积极作用。然而，这些研究在益生菌的剂量和类型、艰难梭菌菌株、抗生素的剂量和类型以及治疗的时机方面有很大的不同。

欧洲[51]和美国[52]的CDI防治指南均建议对于复发性和难治性CDI，经常规治疗无效后可以考虑粪便菌群移植(Fecal microbiota transplantation，FMT)治疗，以恢复患者肠道菌群稳态，减少艰难梭菌定植。发表在《新英格兰医学杂志》上的一篇文章报道了与接受万古霉素治疗相比，经十二指肠FMT治疗复发性CDI的成功率为80%[53]。FMT是治疗CDI的一种高效方法[54]，已被证明能诱导微生物区系恢复。移植的正常的肠道菌群可以竞争性抑制艰难梭菌的生长，同时产生氨基酸、SCFAs、次级胆汁酸等代谢物，从而抑制艰难梭菌的定植和生长。研究证明FMT后丁酸、乙酸和丙酸等短链脂肪酸的水平持续升高，脱氧胆酸和石胆酸等次级胆汁酸随时间变化有不同的恢复。这些增加的代谢物与毛螺菌科、瘤胃菌科和未分类的梭菌属的细菌有关，而初级胆汁酸与这些菌群呈负相关[55]。Weingarden等描述了粪便胆汁酸成分调节CDI的有力证据，患者进行FMT前的样本中缺乏石胆酸、脱氧胆酸等次级胆汁酸，而进行FMT后捐赠者的样本中胆酸和鹅脱氧胆酸等初级胆汁酸显著减少[56]。类似地，Allegretti等研究发现，与来自健康对照组的样本相比，初发和复发CDI患者的样本中初级胆汁酸水平显著升高，次级胆汁酸水平显著降低。他们还指出，与初发CDI患者的样本相比，复发病例的样本中初级胆汁酸显著升高[57]。FMT已被证明是治疗复发性CDI最有效的方法。然而，由于受实际情况及道德伦理影响并不是所有的患者都可以进行FMT治疗。

6 艰难梭菌感染的预防

艰难梭菌通过粪-口途径传播，通常住院患者艰难梭菌的携带率为7%～11%。许多艰难梭菌感染患者在治疗成功后成为无症状携带者，并通过孢子在宿主之间传播[58]，预防CDI最重要的是合理的使用抗生素和控制感染途径[59]。特别是在艰难梭菌感染暴发期间，减少艰难梭菌的传播需要严格遵守接触预防措施，原因不明的腹泻患者需要进行隔离。医护人员都应采取手部卫生和物理防护措施，包括戴手套和穿防护服。艰难梭菌芽孢对消毒剂如乙醇、高温、紫外线等有较强的抵抗性，酒精不能杀死艰难梭菌的孢子[60]，可以在物体表面存在数月到数年，从而在人群中传播。用肥皂水洗手比使用酒精擦手更有效地清除艰难梭菌。因此，建议先用肥皂和水洗手，然后用含酒精的洗手液消毒，使用具有灭孢子功能的产品进行环境消毒，例如稀释次氯酸钠(家用漂白剂)[52]。

一些研究提出益生菌可作为艰难梭菌高危人群预防性治疗[61-62]，但目前的研究仍存在争议，没有足够的数据，建议在临床实验之外使用益生菌作为CDI的预防。在益生菌被纳入预防措施之前，迫切需要专门研究确定益生菌是否有效，以及确定哪种类型的细菌、剂量和服药时间可以降低CDI的风险。因此，关于艰难梭菌的防治指南中并未明确将益生菌作为预防感染的方法。益生元可以被肠道微生物选择性利用，产生对人体有益的物质，降低艰难梭菌在肠道的定植。动物实验研究发现水苏糖能够改善肠道微生物丰富度，多形拟杆菌回复部分胆汁酸水平，两者选择性地改变了某些菌种的相对丰度[63]。随着人们对肠道微生态研究的进一步认识，未来肠道微生态及其代谢物和免疫因子可能会成为预防CDI的突破口。

7 结 语

艰难梭菌感染与肠道微生态紊乱互为因果，正常的肠道菌群是机体抵抗艰难梭菌的主要保护屏障。艰难梭菌感染严重威胁患者健康，临床上控制艰难梭菌感染途径和合理应用药物对于防治艰难梭菌感染至关重要。