邵思迈,史 洺,余姊阳,原 野,游言文,郝 莉,张紫娟,张振强*
(1.河南中医药大学基础医学院,郑州 450046;2.河南中医药大学中医药科学院,郑州 450046)
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的两个典型病理特征分别是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP) 的水解产物 β 淀粉样肽(amyloid-beta protein,Aβ)组成的胞外老年斑(senile plaque,SP)和微管稳定蛋白质(Tau)病理性磷酸化改变组成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)[1]。 越来越多来自遗传代谢、体内成像和生化研究的证据表明,寡聚、可扩散的Aβ 肽组合体的累积是AD 发生发展过程中的早期事件,甚至是启动病理性级联反应的关键[2]。
当氧化还原平衡被打破, 过多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在脑内产生、蓄积,使脑细胞膜系统的蛋白、脂质和DNA 等大分子发生氧化,即氧化应激(oxidative stress,OS)。 研究表明Aβ淀粉样聚集会使线粒体氧化还原活性降低,引发ROS 累积[3]。 毒性Aβ 诱导的受损线粒体能通过触发N-甲基-d-天冬氨酸受体依赖的Ca2+流,导致大量ROS 的产生,而ROS 增加引起的氧化应激和许多抗氧化酶系统功能损伤与AD 发展有着重要联系[4]。此外,氧化应激会进入恶性循环,因为氧化产物ROS 会造成生物大分子的破坏,进一步导致更高水平的ROS 积累。 故下文重点论述了AD 中毒性Aβ的产生机制,大分子氧化及Aβ 诱导氧化应激的过程,希望阐明AD 发生发展过程中淀粉样肽与氧化应激的关系,希望对今后阿尔茨海默病抗氧化剂靶向研究有所帮助。
Aβ 是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶切产生的肽片段,也是AD 患者脑组织内老年斑的主要成分。 淀粉样蛋白级联学说认为,Aβ 沉积不仅会形成老年斑,而且沉积后纤维化且有神经毒性的Aβ 是AD 产生的重要原因[5]。
APP 是一种特别存在于中枢神经系统(central nervous system,CNS)中的大分子跨膜糖蛋白,其表达可因氧化应激而增强。 在APP 结构中存在多种特异性的水解位点,β/γ 位点的裂解酶切可产生有神经毒性的、具有 40 或 42 个氨基酸的肽段:Aβ1-40/42(Aβ40/Aβ42)[6],而 γ-酶切位点的水解产物含有完整 Aβ 序列,可产生 Aβ1-42[7]。 APP 水解的发生主要通过Aβ 生成途径与非Aβ 生成途径[8]。其中Aβ 生成途径是一个连续两步的蛋白水解步骤:首先由β-位点APP 裂解酶1(BACE1)通过切割APP 产生含有99 个氨基酸残基的羧基末端片段(CTF-β),再经γ-分泌酶作用产生由39~43 个氨基酸组成的毒性 Aβ 和 CTF-γ[9]。 该途径的主要分泌产物为40-氨基酸形式的Aβ(Aβ1-40)和羧基端含有两个残基的次要42-氨基酸形式,即Aβ1-42,而后者也被认为是阿尔茨海默病发病的起始分子[10]。
Aβ1-42二聚体是Aβ 蛋白寡聚体中最小的聚合单位,也是最小的毒性单位。 Aβ1-42在磷酸盐缓冲液中稀释后能迅速形成纤维,而Aβ1-40孵育48 h 后才能形成纤维且不能形成杂乱肽(杂乱肽即乱序重排肽,是将自然肽氨基酸序列打乱重排产生的新肽,其氨基酸组成与自然肽相同但序列不同,是缺陷产物的一种)[11-12],所以 Aβ1-42比 Aβ1-40更易聚集,沉积时间也更早、更稳定。 在单体和纤维结构的直接激发下,可溶性β-构象诱导神经元损伤的研究结果表明只有寡聚体物会对神经元有损伤。 也有研究表明氧化应激不仅会引发神经毒性,而且会增强 Aβ 的寡聚化程度[13]。 螺旋 Aβ1-42的长度更长、偶极矩更大,所以与Aβ1-40相比具有更高的螺旋稳定性。 高稳定性为自由基诱导脂质过氧化提供了更多时间,也为Aβ1-42是肽最重要的氧化应激位点的观点提供了证据[14]。
除病理状态下脑部出现的神经原纤维增粗双螺旋缠绕扭曲状态, 即神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)外,AD 患者脑中氧化还原平衡状态也会发生改变[15]。 ROS 是氧被部分还原的衍生物,包括氧自由基及其歧化产物[16]。 神经元细胞新陈代谢活跃,在代谢过程中的耗氧量约占人体总量的四分之一,其含有的抗氧化分子水平也更低,所以神经元细胞受 ROS 超负荷的影响最大[17-18]。 ROS 会随着时间的推移逐步累积,并导致过度暴露于ROS 及累积效应的细胞受损退化[18],这也是氧化应激诱发神经退行性疾病假说的依据。研究表明神经元易受细胞衰老微环境影响,Aβ 沉积可通过产生过量的ROS 来诱导细胞老化[19]。 呼吸爆发也称氧化爆发,是免疫系统中的一种氧依赖性杀菌途径,这一途径会生成大量自由基,进一步加剧Aβ 的沉积,形成恶性循环。 在ROS 诱导氧化应激的过程中,有神经毒性的ROS 会攻击蛋白质、核酸和脂质膜,使细胞的功能和完整性遭到破坏。这一过程也使氧自由基大量形成,并与邻近脂肪酸链的氢分子不断结合形成脂氢过氧化物,使脂质过氧化过程不断循环。 所以氧化应激多表现为蛋白质过氧化、脂质过氧化反应产物和神经毒性物质(如Aβ1-42)的形成及核酸的过氧化修饰[20]。 Aβ1-40和Aβ1-42水平的升高也与海马和皮质中蛋白质、脂质和核酸的氧化产物水平增加有关[21]。
AD 中的蛋白质氧化主要可分为羰基化和硝基化。 在APP / PS1 双转基因小鼠实验中,培养的原代神经元对外源Aβ1-42诱导的氧化应激与亚硝化应激的敏感性增加[22]。 在早发性AD 病人额叶皮质中观察到蛋白质羰基水平增加引起了酶的诱导反应,同时脂质过氧化物如丙二醛(malonaldehyde,MDA)等水平升高[23]。 另一项实验中检测到AD 脑中蛋白质硝基化、 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)水平均显著增加,这两者的一致上调表明硝基化在AD 发生发展中起作用[23]。
过度的脂质过氧化是大多数神经退行性疾病的标志。 脂质过氧化物(lipid peroxide,LPO)是不饱和脂肪酸与ROS 结合的产物,会通过非酶解作用产生有强毒性的4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)。 用与AD 患者脑组织类似浓度的4-HNE 诱导神经元观察到神经元内的 Aβ 明显增加2~6倍[24]。 胚胎成纤维细胞被过氧化氢诱导可引起细胞中4-HNE 水平增加,γ-分泌酶活性上调,从而加剧APP 的裂解。 过氧化的低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)能使Aβ 被清除能力下降,导致 Aβ 聚集。而与此结论一致,4-HNE 绑定跨膜的LRP1 后,AD患者脑中Aβ 含量在海马区显著增加[25]。
在AD 发病所涉及的机制中,氧化应激反应造成的细胞成分的破坏是关键因素。 核酸的氧化标记物为定位在Aβ 聚集形成的SP 和NFT 上的8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)和 8-羟基鸟苷 (8-hydroxy-guanosine,8-OHG)。 8-OHG 在早发性AD 病人海马和额叶皮层中表达的增加证实了核酸过氧化与Aβ 聚集相关[26]。 有临床实验采用超高效液相色谱-串联质谱法测定了80例患者DNA 的氧化产物,其中8-OHdG 和8-OHdG/2dG 的比值在AD 和健康者间的差异有统计学意义,可推测 DNA 氧化是 AD 的早期分子途径[27]。RNA 氧化,尤其是额叶皮质的mRNA 氧化也会在AD 中发生[28]。 同时 Nunomura 等[29]也提出,尽管神经元RNA 氧化基本上是与年龄相关的现象,但RNA 损伤与 AD 前驱阶段认知障碍的发作明显相关。
Aβ 是AD 发生发展中神经元损伤与氧化应激之间的桥梁。 桑德斯-布朗衰老研究中心发现:在AD 中,富含Aβ1-42的脑区氧化应激和大分子过氧化水平升高,而在 Aβ1-42较少的脑区则相反[30]。 Aβ会导致蛋白质被氧化修饰、功能降低并使其发挥作用的关键生化和代谢途径受损:包括葡萄糖代谢途径、mTOR 激活途径、蛋白质平衡网络和蛋白质磷酸化等[30]。 在 AD 发展过程中,APP 产生 Aβ 时会产生大量自由基;Aβ 也可以直接诱导神经元产生自由基;氧化应激诱导神经元发生脂质过氧化,并由它们的降解产物进一步氧化修饰亚细胞结构,影响神经元的功能和细胞膜的结构完整性,导致AD 一系列病理变化的产生[31]。 关于Aβ 的硫磺素染色实验也表明,在AD 早期即9 周龄时,5×FAD 小鼠脑内已出现Aβ 沉积阳性结果并伴有工作记忆的下降,提示淀粉样斑块在形成初期即已导致认知功能损伤[32]。 Murakami 等[33]的实验证明,氧化应激会加速AD 转基因小鼠Aβ 寡聚体的形成和记忆缺失,而Aβ42突变体能诱导胞内ROS 大量生成并进一步对神经元产生细胞毒性。 在Li 等[1]研究中发现,E22P-Aβ42促进了细胞内 ROS 的生成,说明毒性Aβ42的形成对细胞内ROS 产生起关键作用,而且E22P-Aβ42比 Wt-Aβ42更快形成了聚集物的毒性中间体,表明胞浆内自由基过多可直接导致Aβ42的寡聚。 连续两周对大鼠注射Aβ1-42,会使其脑内海马、皮质等部位的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等抗氧化物质生成减少,由此引起大鼠学习能力与记忆功能障碍,表明Aβ1-42能损伤体内抗氧化系统[34]。
另一方面,Aβ 同时在线粒体中起作用。 França等[35]的实验分析了氧化应激是淀粉样蛋白级联反应的原因还是后果,以及抗氧化防御系统在这一过程中的作用。 体外细胞研究结果表明,Aβ 的存在提高了细胞内氧化水平,诱导了过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和乌头酸酶等的活性。 Aβ 还改变了耗氧量和复合体III 和IV 的活性,表明Aβ 的毒性机制是通过增加线粒体内ROS 的产生而诱导氧化应激的。 在Aβ 高表达期间,线粒体中的ROS 浓度更高,以维持细胞器内氧化还原平衡,而这种防御系统正是淀粉样蛋白Aβ 表达过程中维持线粒体完整性的基础。
在无外界影响的条件下,脑内Aβ 沉积是不可逆的过程。 但最新研究发现,有靶向的抗氧化药物可能实现这一过程的逆转,说明氧自由基的代谢过程是一个动态调节过程。
神经退行性疾病的致病因素大都涉及到氧化应激,目前淀粉样β 蛋白的毒性和氧化应激是中心假说之一。 抗氧化剂是发挥延迟或抑制底物氧化作用的内源或外源性分子,有清除ROS、抑制ROS生成和内源性抗氧化剂的再生等多种机制[36]。 有证据表明抗氧化剂和自由基清除剂可通过抵抗Aβ诱导的氧化应激和体内外脂质过氧化来保护神经元[37]。 核因子 E2 相关因子 2/血红素加氧酶-1( nuclear factor erythroid-2-related factor2/heme oxygenase 1,Nrf2/ HO-1)信号通路是一条针对应激环境的多脏器保护通路,该通路通过调控抗氧化剂表达水平及表观遗传发挥抗氧化应激作用,可将内源性应激拒于机体外,延缓疾病进展[38]。
NXPZ-2 是一种直接抑制Kelchlike ECH 相关蛋白1(Keap1)-Nrf2 相互作用的化合物,用NXPZ-2 处理注射Aβ 寡聚体建立的小鼠模型,小鼠全细胞裂解产物检测中Nrf2 上调、核移位增加、靶向抗氧化酶HO-1 和NQO-1 增加,这表明 NXPZ-2 可能是一种很有前途的AD 治疗剂,并支持Keap1-Nrf2 相互作用作为AD 中Nrf2 重新激活的有效靶点[39]。 p53凋亡刺激蛋白抑制因子(iASPP)的减少与APP/PS1转基因小鼠脑组织对氧化应激的易感性有关。 抗氧化剂紫丁香素的处理导致iASPP 上调,iASPP 与Keap1 的相互作用增加,其介导的Nrf2 核转位可通过iASPP/Nrf2 轴促进Nrf2 下游基因的激活,恢复细胞的氧化还原平衡[40]。
总之,氧化应激反应与AD、Aβ 沉积之间有着密切的关系。 近年来的诸多实验结论均可表明:具有清除活性氧和抑制氧化酶活性功能的物质都可以用来缓解因Aβ 毒性诱导的神经元细胞损伤。 今后,对于氧化应激、Aβ 与AD 之间的关系进行深层次的研究是非常必要的,不论是对阐明阿尔茨海默病发病机理,还是对寻找预防策略及治疗方案都有着非常重要的意义。