过量锰和铁单独或联合暴露致中枢神经毒性研究进展

卢丽郦，梁 元，方媛媛，邓 月，姜岳明

（广西医科大学公共卫生学院毒理学系，广西 南宁 530021）

锰和铁均是人体正常生长和生理功能的必需微量元素，在各种酶促反应中起着十分重要的作用。但如长期暴露于高浓度锰烟尘（混杂有铁）则可能会引起锰中毒，甚至出现帕金森病（Parkinson disease，PD）样综合征。SH-SY5Y细胞染锰或铁（均20 μmol·L-1）24 h，对SH-SY5Y细胞存活的抑制率分别为30%和35%［1］。锰和铁易蓄积在中枢神经系统，引起神经毒性，其毒作用机制可能与氧化应激、线粒体功能障碍、细胞凋亡、自噬、蛋白质稳态失衡和炎症有关［2］。随着环保技术的快速发展，作业环境空气中锰烟尘浓度不断降低，锰中毒患者明显减少甚至十分少见。但锰铁合金冶炼或焊接作业不仅有锰或铁单独暴露，也存在锰、铁联合暴露，可能会促进或加重脑损害，也可能是PD发病的重要因素之一。本文就过量锰或铁单独及联合暴露致中枢神经毒性的研究进行综述，以期为锰、铁单独及联合暴露的神经毒性防治提供科学依据。

1 过量锰暴露的中枢神经毒性

1.1 帕金森病样综合征

锰中毒早期主要表现为类神经症和自主神经功能障碍，如厌食、烦躁、情绪波动、注意力障碍和反应时间缩短。随着锰中毒加重，会出现肌张力增高、手指细小震颤并有神经情绪改变等锥体外系神经受损症状和体征。锰中毒后期，会出现典型的PD症状，如语言含糊不清、面部表情减少、步态慌张等［3-4］。锰中毒症状与特发性PD的锥体外系症状相似，有相似的分子机制，如线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质聚集改变和激活凋亡细胞死亡途径，但临床表现和病理学特征不一致［5］，治疗对策也不完全相同。因此，过量锰暴露是否导致PD尚待进一步研究。

1.2 抑郁症

焦虑或抑郁是锰中毒的最初精神病学表现之一。工人神经精神症状（包括抑郁）与锰暴露水平有量效关系。锰暴露平均浓度为138.4 μg·m-3、工龄16年的焊工，尿5-羟吲哚乙酸水平降低［6］。幼年啮齿类动物和非人灵长类动物喂饲含锰食物4个月后，脑脊液5-羟色胺及其代谢物5-羟吲哚乙酸水平降低［4］。据职业卫生横断面研究（又称现况调查），在调整生活状况和尿肌酐等混杂因素后，成人较高的尿锰含量与抑郁症相关［7］。在长期经胃肠外营养补锰（一般是儿科巨结肠术后）的16例患者中，66%患有抑郁症［8］。注意缺陷多动障碍患儿血锰水平与焦虑或（和）抑郁发生具有明显相关性［9］。

1.3 可能的作用机制

过量锰蓄积在黑质苍白球和纹状体，可引起神经元损害和胶质细胞增生，导致锰中毒［10］。锰可经Ca2+通道快速进入线粒体基质。线粒体锰排出缓慢，以致线粒体Ca2+蓄积，并经电子传输链促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，抑制有氧呼吸。培养的星形胶质细胞对锰高度敏感，并继发线粒体功能障碍和细胞凋亡。锰可使谷胱甘肽减少，抑制过氧化物酶活性，使线粒体呼吸功能受阻，诱导ROS生成增多，并抑制抗氧化系统。锰暴露可促进大鼠大脑氧化应激标志物如二硫化谷胱甘肽、前列腺素和脂质标志物（15羟二十碳四烯酸）浓度增加，提示锰可使氧化应激增强［11］。

2 过量铁暴露的中枢神经毒性

2.1 与脑铁含量过多有关的神经系统疾病

脑铁含量过高会引起大鼠严重的记忆缺陷，并伴有氧化应激标志物硫代巴比妥酸反应产物增加和海马突触球蛋白减少，还可能通过诱导大脑氧化损伤而诱发认知障碍［12］。与脑铁含量过多有关的神经系统疾病有阿尔茨海默病（Alzheimer dis⁃ease，AD）、PD、亨廷顿舞蹈症（Huntington disease，HD）和铜蓝蛋白血症（aceruloplasminemia，ACE）。AD主要是海马完整性丧失，与铁蛋白水平升高和铁转运蛋白减少有关，AD患者β样淀粉蛋白斑块内铁增加，磁共振成像（magnetic resonance imag⁃ing，MRI）检出脑铁蓄积［13-16］。PD患者黑质致密区域有较高的铁蓄积，纹状体多巴胺能神经元变性［8，17-22］。HD患者和HD模型小鼠大脑线粒体铁蓄积，锰水平降低，线粒体功能障碍，其中铁摄取蛋白表达增加，铁硫簇合成蛋白减少［23-24］。ACE患者多铜氧化酶（具有铁氧化酶活性的铜蓝蛋白）转移到细胞外转铁蛋白后，可引起氧化亚铁（FeO）增多，导致脑铁蓄积（主要是Fe2+）和神经变性［25］。

2.2 可能的作用机制

过量铁暴露诱导中枢神经毒性的机制主要与氧化应激有关，铁具有比较活泼的化学性质和氧化还原电位，能将铁蛋白的Fe3+转变为Fe2+，后者有还原性且不稳定，更易产生ROS［26］。过量Fe2+和Fe3+暴露使大鼠脑细胞线粒体肿胀，出现剂量和时间依赖性改变，使ROS产生过多。线粒体钙单转运体阻滞剂可有效减轻铁过量引起的脑细胞线粒体功能障碍，推测线粒体钙单转运体可能是铁进入脑细胞线粒体的主要通道［27］。

经饮用水染铁（10 mg·L-1，6个月）小鼠在逐步降低被动回避测试和Morris水迷宫测试中显示空间记忆障碍。在Morris水迷宫测试的5 d中，与正常对照组比较，染铁小鼠逃避潜伏期延长，尤其是在训练的第2，4和5天；染铁小鼠探索时间延长，穿越平台区次数减少，推测慢性铁暴露可引起小鼠空间记忆缺陷。与正常对照组比较，染铁小鼠海马有66种蛋白表达差异明显（30种增加，36种减少）。差异蛋白主要包括突触关联蛋白25、复合素1、囊泡相关膜蛋白2、神经软骨蛋白、线粒体相关蛋白和神经丝轻链多肽等，提示海马突触、线粒体和细胞骨架蛋白的失调可能与铁触发的记忆障碍有关，为铁暴露导致神经毒性分子机制研究提供了新见解［28］。

经饮用水染铁（柠檬酸铁铵5 g·L-1，3个月）的野生型和淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早老蛋白1双转基因模型小鼠大脑皮质和海马二价金属转运蛋白1（divalent metal transpoter 1，DMT1）和运铁素表达上调，转铁蛋白受体表达下调，神经元数量明显减少。此外，染铁诱导的神经元丢失可能涉及ROS增加和线粒体氧化功能障碍，DNA修复减少，使细胞凋亡和自噬增强，提示慢性铁暴露使细胞凋亡、自噬和含铁细胞增多，以致AD发生的风险升高［29］。

小胶质细胞经脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）炎症激活后烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）上调，促进氧化应激。FeSO4和LPS联合作用于小胶质细胞24 h后，与单独染铁或LPS相比，可增强LPS诱导ROS产生。用NOX2及NOX4抑制剂处理LPS和FeSO4共培养小胶质细胞，可使ROS恢复至正常对照组水平。表明NOX2和NOX4是铁诱导小胶质细胞发生氧化应激潜在的作用靶点［30］。

3 过量锰、铁联合暴露的中枢神经毒性

锰铁合金冶炼或焊接作业不仅有锰、铁的独立暴露，也存在其联合暴露，它们的相互作用可能加重脑的神经损害［31］。

3.1 职业人群调查

焊烟尘有多种金属，包括锰和铁，可能会损害神经系统。近年来，定量MRI技术如苍白球指数（pallidal index，PI）、弛豫率（relaxation rate，R）、定量磁化率成像（quantitative susceptibility map⁃ping，QSM）和弥散成像（diffusion tensor im⁃aging，DTI）被用于研究锰、铁暴露引起的神经改变，其中PI和R1〔1/纵向弛豫时间（T1）〕主要反映脑锰蓄积水平，R2〔1/横向弛豫时间（T2）〕和QSM反映脑铁蓄积，DTI主要反映组织微结构改变［32-36］。据报道，在低水平锰暴露的无症状焊工中，①锰首先可能以非线性方式在脑蓄积，MRI R1信号仅在达到临界锰暴露水平后才明显增加（如在MRI检查前90 d内焊接≥300 h）。R1可能是一个更敏感的暴露生物学标志，可反映锰蓄积的短期动态变化。②慢性锰暴露可能导致基底核微结构变化，如基底核扩散张量分数各向异性（anisotropy）值降低，特别是焊接工龄＞30年时。③通过协同作用参数（运动稳定性指数）可以灵敏地捕获与锰有关的微小运动功能障碍；④铁可能在焊接作业有关的神经毒性中起作用，特别是在低水平锰暴露工人基底核R2值较高。⑤较高的R2值与较低的音韵流畅性（phonological fluency）相关［36］。无症状焊工尾状核R2明显高于对照组，音韵流畅性测试表现较差，其发音流利度得分与尾状核R2呈负相关。提示无症状焊工神经行为表现异常可能与尾状核铁蓄积较高有关［32］。应用DTI检测无症状焊工基底核微结构的完整性，发现焊工PI各向异性值明显降低，且与长期暴露、血锰和PI呈非线性关系。PI各向异性值在达到长期锰暴露或临界水平后降低，并随PI值增加而降低，直到PI最高值趋于稳定。提示PI各向异性值反映了低水平慢性锰暴露致工人脑微结构变化，可能是无症状焊工神经毒性的效应生物学标志［33］。

多位数字协同效应（multi-digit synergies）是最近发展起来的一种以理论为基础的量化运动稳定性的方法，它可反映与PD相关的基底核功能障碍。据报道，焊工左侧苍白球协同指数（synergy index）减少。焊工左侧苍白球协同指数越高，左侧苍白球分数各向异性（fractional anisotropy）值就越高，提示在焊工和其他有PD症状的神经退行性疾病风险人群中，多位数字协同效应可能是基底核功能障碍的非临床标志物［35］。焊烟尘有锰和铁，它们可能相互作用，导致与焊烟尘有关的神经毒性。Lee等［34］报道，焊工血铁水平明显高于对照组。焊工在控制年龄和体重指数、呼吸器使用、尾状核R1、血铜和锰含量后，尾状核R2明显高于对照组，且与血铁浓度呈正相关，提示该脑区铁蓄积增高。

3.2 可能的作用机制

铁与锰的化学特征相似，且其还有氧化还原活性。铁和锰的相互作用是由于它们在吸收、迁移机制上的某些相似性所致，其特异性转运蛋白可共同调节脑和外周神经组织锰含量的分布。染锰使PC12细胞转铁蛋白受体mRNA表达明显增强，并伴随铁含量升高［37］。锰和铁可竞争结合转运蛋白，在金属运输中Fe2+与DMT1的亲和力比Mn2+弱［38］。在经饲料染铁的大鼠模型中，血清锰浓度降低，且DMT1和铁转运蛋白1表达减少，DMT1和铁转运蛋白1可能是大鼠血清中与锰和铁具有竞争作用的蛋白［39］。与DMT1相同，其他转运蛋白（如ZIP8和ZIP14）在鼻腔上皮中的表达促使吸入的纳米锰颗粒直接进入大脑，导致大脑氧化应激，ROS产生［40］。

锰可剂量-时间依赖性地阻断APP和重链铁蛋白（ferritin H china，FTH）的翻译，且这2种铁稳态蛋白均具有神经保护功能。锰暴露可抑制APP和FTH的5′-非翻译区活性，可能通过增加铁反应蛋白-铁反应元件的结合，阻断其蛋白翻译。APP和FTH保护轴（protective axis）的缺失，导致不稳定Fe2+蓄积，并产生ROS。锰配位的化学性质与Fe2+十分相似，锰与铁反应蛋白相互作用并加速细胞质和脂质ROS的积累，以致氧化应激加剧。用C57小鼠急性和SD大鼠慢性锰暴露实验模型验证了锰介导的APP和FTH抑制，导致铁代谢受阻和氧化应激产生［41］。

铁和锰的细胞稳态受损也可经各种机制触发神经退行性变，特别是诱导氧化应激，促进α-突触核蛋白聚集和原纤维形成，激活小胶质细胞，导致炎症和金属蛋白产生受阻［42］。

4 结语

单独锰、铁暴露及其联合暴露可影响神经发育，导致神经退行性疾病，长期威胁职业暴露和环境暴露人群的健康。实验性过量锰、铁暴露的中枢神经毒性及其机制有较多的研究，但职业人群调查的脑影像学资料十分有限，且缺乏作业环境空气锰、铁暴露浓度数据的支撑。尽管定量MRI显示焊工脑铁蓄积非常严重，但仍未引起有关职业卫生管理部门和科研工作者的重视。随着科技发展和环保工作的重视，作业环境空气锰浓度明显减少，远低于国家职业卫生标准限值。但低水平锰暴露工人的健康问题仍然存在，焊工锰中毒不乏报道，究其病因很难完全归咎于焊烟尘锰暴露，过量铁暴露及其潜在健康效应不可忽视。目前，冶炼、焊接作业环境空气烟尘铁水平及其健康效应也未见报道，国内外尚未按神经毒性制订过量铁暴露的职业卫生暴露限值。因此，过量锰、铁联合暴露引起的中枢神经毒性及其健康效应尚有待深入探讨。深入研究锰、铁神经毒性的细胞和分子机制是了解其毒性和制定预防对策的关键。