人轮状病毒疫苗研究进展

王 俊，闻晓波，冉旭华

轮状病毒(rotavirus, RV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，是引起婴幼儿及幼龄动物轮状病毒性腹泻的主要病原体[1]，临床症状为呕吐、腹泻、脱水，严重的可造成死亡。轮状病毒在全球感染广泛，据统计，全球每年超过20万婴幼儿、儿童死于轮状病毒感染相关性疾病，其中在发展中国家5岁以下儿童死亡人数占总死亡数的85%，造成了巨大的经济和社会负担[2]。目前尚无特效药物对轮状病毒性腹泻进行治疗，只能通过疫苗进行预防。因此，研发安全、高效的疫苗对预防和控制轮状病毒性疾病的发生以及降低经济损失具有重要意义。本文根据目前各国学者的研究结果对国内外轮状病毒疫苗的研究现状做一综述，为轮状病毒疫苗研发相关工作提供一定的参考。

1 轮状病毒概况

轮状病毒为二十面体对称的双链RNA病毒，直径约70 nm，无囊膜，完整的具有感染性的病毒粒子为三层衣壳结构，其中最内层衣壳由VP1、VP2、VP3蛋白构成，中间层由VP6构成，最外层由VP4、VP7构成。轮状病毒基因组约为18 555 bp，由11个节段组成，编码6种结构蛋白和5种或6种非结构蛋白(VP1～VP4，VP6，VP7，NSP1～NSP5或NSP6)[3-4]。其中结构蛋白VP4为纤突蛋白，具有黏附细胞的功能，在富含胰蛋白酶的肠道环境中可裂解为VP5*和VP8*；VP7糖蛋白为主要的中和抗原，具有CTL识别的抗原决定簇，同时能够调节细胞膜Ca2+浓度，改变细胞膜通透性。VP6可刺激机体产生IgA，IgA与多聚免疫球蛋白受体结合并转运至肠腔，转运中与双层病毒颗粒结合抑制轮状病毒的转录和复制，也为轮状病毒候选疫苗的研究提供了方向。

轮状病毒根据血清学分类方法，可将已鉴定出的轮状病毒毒株可分为A～J 10个群，引起婴幼儿和幼龄动物腹泻主要为A群[5-7]。外衣壳蛋白VP4、VP7与中和抗体的反应性决定了轮状病毒的血清型，根据外衣壳蛋白VP4、VP7的抗原性，又可将A群轮状病毒分为P血清型(protease sensitive)和G血清型(glycoprotein)[8-9]。最新研究表明，目前已鉴定出可感染人和动物的血清型中，有32种G血清型和47种P血清型[10]。

2 轮状病毒现有疫苗概况

鉴于轮状病毒的高发病率和高死亡率，世界卫生组织(WHO)建议接种轮状病毒疫苗来预防轮状病毒性腹泻。目前使用的轮状病毒疫苗主要有：Rotarix、RotaTeq、Rotavac、ROTASIIL、Rotavin-M1、LLR。其中前4种已通过WHO的使用资格预审。截至2018年底，全球已有92个国家将Rotarix或RotaTeq轮状病毒疫苗纳入其国家免疫计划，另有6个国家分阶段或在个别地区实施了疫苗免疫计划。另外，在国家免疫计划中，74个国家选择Rotarix单价疫苗，14个国家使用RotaTeq五价疫苗；9个国家同时使用Rotarix和RotaTeq[11-12]。随着研究的不断深入，轮状病毒疫苗种类也开始逐渐增加，出现了如非复制型的新型疫苗，但此类疫苗正处于临床试验阶段，未真正投入市场。

2.1Rotashield 四价基因重配苗Rotashield是最早用于预防人轮状病毒性腹泻的疫苗，该疫苗由恒河猴轮状病毒(RRV, G3血清型)与恒河猴-人轮状病毒重配株(G1、G2、G4血清型)组成[13]，1998年在美国上市。相关试验表明，该疫苗对重症轮状病毒性腹泻保护率为69%～90%，对所有轮状病毒性腹泻保护率为49%～68%，但该疫苗在使用中发现与肠套叠等安全性问题存在相关性，于1999年被召回[14]。至此，人轮状病毒疫苗出现了多年空窗期。

2.2Rotarix Rotarix是比利时葛兰素-史克(GlaxoSmithKline, GSK)公司研制的口服减毒活疫苗，Rotarix的毒株为RIX444(G1P[8])，经89-12亲代株传代而来，用于预防6～24周龄婴儿轮状病毒引起的腹泻[15-16]。免疫接种剂量为2剂，每剂间隔4周。该疫苗2005年在墨西哥上市并于2009年通过WHO的资格预审。

Malakalinga等[17]相关研究表明，坦桑尼亚5岁以下儿童接种Rotarix轮状病毒疫苗后，轮状病毒性腹泻死亡率从2008年的72%下降到2013年的36%。相关研究表明，受营养水平、肠道菌群、微量元素、母源抗体水平、遗传因素等因素影响[18]，该疫苗在发展中国家和发达国家的免疫效果也大有不同，在发达国家免疫效果较高，但在一些中等收入和低收入国家，疫苗的免疫效果较差。

Rotarix在使用中，也出现了问题。2010年Victoria等[19]在接种疫苗后婴儿的粪便中检测到了猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)1型DNA片段，尽管后续的研究中证实，Rotarix中污染的PCV-1，只是疫苗生产中的质量控制偶然事件，对免疫接种儿童不会造成严重的安全风险[20]，但是还是有必要进一步研究确认该疫苗潜在的安全性问题。

2.3RotaTeq RotaTeq是美国默克(Merck)公司开发于2006年上市，于2008年通过WHO资格预审的口服五价人-牛重配轮状病毒减毒活疫苗[21]。用于预防6～32周龄婴儿轮状病毒引起的腹泻，免疫接种剂量为3剂。

RotaTeq以牛轮状病毒WC3株为基础，通过基因重配，将人轮状病毒毒株中编码VP4和VP7的基因替代原毒株相应基因得到[22-23]。Sanneh等[24]对冈比亚人群使用RotaTeq疫苗前后轮状病毒发病率进行比较，发现轮状病毒发病率从2013年的22%下降到2015年的11%；对于临床症状严重的患者，轮状病毒发病率从2013年的33%下降到2015年的8%。2019年Mo等[25]对4 040名6～12周中国婴儿进行了III期临床研究，发现疫苗组的抗轮状病毒IgA的几何平均滴度和血清反应率高于对照组，并且RotaTeq和三价口服脊髓灰质炎病毒疫苗(tOPV)[26]和无细胞百日咳疫苗(DTaP)[27]同时使用时，RotaTeq对其他疫苗的免疫应答无影响。与Rotarix相似，RotaTeq的疫苗保护率存在着地区差异，对不同血清型和不同病情程度的轮状病毒性腹泻保护率也有所差异。大量的临床试验证实，RotaTeq疫苗的免疫效力似乎与国家经济水平呈现一定的相关性，例如，该疫苗在发达国家具有较高的免疫效力[28-30]；然而在低收入国家，如非洲、东南亚等国家，该疫苗的免疫效力甚至低于50%[31-32]。

2010—2012年对该疫苗的监测中，Roy等[33]、Bucardo等[34]在婴儿粪便中提取的RV A毒株中发现了RotaTeq衍生的NSP2基因，这表明RotaTeq疫苗株与流行野毒株之间进行了重组。2009年Laserson等[35]对RotaTeq在免疫缺陷人群中的安全性进行了评估，37名HIV感染的婴儿中，5/21名(23.8%)疫苗接种者和2/16名(12.5%)安慰剂接种者出现了严重不良反应。疫苗组死亡8例，其中2例与轮状病毒性胃肠炎有关；对照组死亡4例中3例与轮状病毒性胃肠炎有关，但疫苗组不良反应发生率与对照组无统计学差异。然而此次评估中，免疫缺陷人群数量较少，不能全面评估疫苗对免疫缺陷人群的安全性。

2.4Rotavac Rotavac是由印度Bharat公司研制的一种单价液体冷冻减毒活疫苗。Rotavac应在婴儿6周龄时开始口服免疫，共3剂，每剂间隔4周。Rotavac是一种独特的轮状病毒疫苗配方，无需缓冲即可使用。它可以在2 ℃～8 ℃下保存24个月。该疫苗在2014年上市，并于2018年通过WHO的资格预审，这也是继Rotarix、RotaTeq通过资格预审后的10年内新一代通过资格预审的疫苗，目前只在印度和巴基斯坦使用，随着研究不断深入，相信不久能够全球推广。

Bhandari等[36]一项临床试验对该疫苗的有效性进行了评估，在免疫接种第1年里，疫苗的有效率为56.4%，第2年疫苗的有效率为49%。2020年，Bhandari等[37]对印度婴儿接种Rotavac后出现肠套叠的风险评估发现，肠套叠在第1次免疫和第2次免疫后21天内的相对发病率(风险期发病率与对照之比)为1.56，在第3次免疫后的相对发病率为1.88，接种疫苗并没有增加肠套叠风险。一系列的试验和监测表明，该疫苗在婴儿中安全有效，并且和其他轮状病毒活疫苗无明显差异，能够安全有效地与其他婴儿疫苗同时使用，不会干扰其他疫苗的免疫应答，有望成为下一个全球使用的疫苗。然而，对于该疫苗潜在的安全性问题，目前只有少数肠套叠的报道，没有足够证据来评估其与肠套叠的相关性，不能准确判断其风险，仍然需要大量试验来进一步的评估和监测。疫苗目前采用的是冷链运输和储存，这一过程涉及储存、运输、配送等各种物流问题，而由于疫苗储存和运输设施的不足，会造成疫苗的大量浪费，使疫苗的成本大幅上升。因此国家在推广疫苗时，不仅要考虑疫苗成本，还需考虑冷藏设施的运输成本和相关人员服务费用，尤其是在农村地区受电力供应影响情况下的成本。

2.5ROTASIIL ROTASIIL是印度血清研究所研制的牛-人轮状病毒五价减毒活疫苗，其血清型包含G1，G2，G3，G4和G9。ROTASIIL为冻干粉剂，可在37 ℃稳定保存18个月，并且能够短期暴露于55 ℃的环境中，使用方便，只需在口服之前添加柠檬酸-碳酸氢盐缓冲液[38]。该疫苗免疫方法与Rotavac相同，6周龄时开始首免，共3剂，每剂间隔4周。ROTASIIL在2018年通过WHO的资格预审，目前只在印度使用。

两项III期临床试验对ROTASIIL的有效性进行了评估。在印度，该疫苗对重症轮状病毒性腹泻保护率为54.7%～60.5%，对所有轮状病毒性腹泻保护率为36%～39.5%。在尼日尔，针对重症轮状病毒性腹泻，疫苗的保护率为67%，与对照组相比，疫苗组的不良事件发生率无统计学差异[39-40]。因此，ROTASIIL是一种安全有效的疫苗。由于ROTASIIL使用的局限性，目前不能准确判断其潜在风险，不同地区存在不同的检测结果，仍需大量试验表明其真正安全有效，才能商品化销售。由于该疫苗是一种减毒活疫苗，所以维持抗原的生物学结构是疫苗免疫的关键。冷冻干燥能够保持抗原的结构和性状，防止疫苗成分之间不必要的化学反应，并根据储存温度延长保存期，但是冻干会破坏疫苗的稳定性，使约40%的病毒失去活性[41]。柠檬酸-碳酸氢盐缓冲液的加入能维持pH，提高抗原蛋白的缓冲密度，从而形成分子间氢键，在冻干的过程中维持抗原的结构和性质。但是这一进展并未改善冷链储存和运输方面的问题。

2.6Rotavin-M1 Rotavin-M1是越南研究人员从一名儿童身上分离的G1P[8]株制成的冷冻减毒活疫苗，Rotavin-M1在6周龄开始口服免疫，共2剂，每剂间隔30 d。该疫苗在2012年上市，目前只允许在越南使用。

2012年Dang等[42]对该疫苗安全性和免疫原性进行了评估。在婴儿中，轮状病毒IgA血清转化率高达73%，并且Rotavin-M1不会导致发热、腹泻、呕吐或过敏的几率增加，表明该疫苗对越南婴儿安全性和免疫原性较好。然而，该疫苗是否存在肠套叠等风险，目前没有相关试验的报道，没有足够的证据来评估其与肠套叠的相关性。

2.7LLR 兰州羔羊轮状病毒疫苗(LLR)是兰州生物制品所研制的单价减毒活疫苗，其采用1985年首次分离的羔羊轮状病毒株G10P[12]接种新生牛肾细胞，经培养、收取病毒液、加稳定剂后制成，为粉红色液体。LLR疫苗在婴幼儿2个月至3岁时服用，每年1次。该疫苗2001年在中国上市，目前只批准在中国使用。

由于缺乏III期临床试验，不同时间段和不同地区的病例对照研究估计了疫苗的有效性。研究表明不同时间段和地区产生的疫苗有效性从35%到77%不等[43]。2020年Xia等[44]对该疫苗的安全性和免疫原性进行了评估。对于6至13周的中国婴儿，疫苗对任何程度的轮状病毒性腹泻、重症轮状病毒性腹泻和任何血清型所致的住院患儿的有效率分别为56.6%、70.3%和74.0%。并且疫苗组的抗轮状病毒IgA的几何平均滴度和血清反应率明显高于对照组。由于LLR疫苗的免疫效力、安全性只适用于中国，并且各项保护效力评价标准不同，导致各数据间无法比较，进而限制了该疫苗的推广使用。

3 轮状病毒候选疫苗概况

使用减毒活疫苗在预防病毒性疾病时存在一定的风险因素，迫切需要一种安全、有效、质量可控、易于免疫识别的新型疫苗。随着科学技术的不断进步以及人们对轮状病毒的重视，极大促进了轮状病毒疫苗的研发进度，开始出现不同类型的新型疫苗。其中认为最具有发展前景的是非复制型疫苗。

3.1RV3-BB单价活疫苗 RV3-BB是以自然减毒的新生儿G3P[6]轮状病毒株为基础研发的口服疫苗。Bines等[45]在印度尼西亚的一项临床试验中评估了RV3-BB的有效性。免疫接种后，新生儿组疫苗的有效率为94%，婴儿组疫苗的有效率为77%，两组均检测到免疫应答反应，且两组疫苗耐受性良好，说明RV3-BB具有预防轮状病毒性腹泻的疫苗应用前景。同时进一步试验表明RV3-BB与OPV联合使用时不会降低任何一种疫苗的免疫原性。该疫苗是目前发展最快的候选疫苗。

3.2多价人-牛重配疫苗 多价人-牛重配疫苗是在四价基础上将人轮状病毒6种血清型的VP7基因替换牛轮状病毒UK毒株相应基因研制出的一种六价重配疫苗[46-47]。四价重配苗(BRV-TV)具有反应性低、效率高的特点，两剂BRV-TV疫苗足以诱导对重症轮状病毒性腹泻的保护，且接种后无明显发热反应，相信六价疫苗的保护效力更好，安全性更高，是一种很有前途的轮状病毒候选疫苗，目前已完成Ⅲ期临床试验人员的招募。

3.3病毒样颗粒疫苗 病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)是一种基因工程亚单位疫苗，由一种或多种病毒的衣壳蛋白组成，与天然病毒有相似的空间构象，但不包含遗传物质，目前广泛应用于疫苗、基因治疗、药物载体和材料科学等方面[48]。

1987年Estes等[49]利用杆状病毒表达系统合成轮状病毒主要衣壳抗原，拉开了研究轮状病毒样颗粒疫苗的帷幕。Fromantin等[50]利用表达VP2和VP6的重组杆状病毒共感染昆虫细胞，成功制备出轮状病毒2/6-VLP，经鼻免疫小鼠后可引起高血清抗体反应。Shuttleworth等[51]利用重组杆状病毒-昆虫细胞表达系统把两种轮状病毒衣壳蛋白(猿猴VP2和小鼠VP6)自组装成VLP 2/6，小鼠腹腔注射后可引起强烈的免疫应答。另外，口服VLP 2/6可不依赖佐剂，进一步证明VLP 2/6是一种有效的免疫原。Istrate等[52]将RF 8-2/6/7-VLP与轮状病毒VP8蛋白融合到截短的VP2氨基端制备出RF 8-2/6/7轮状病毒样颗粒，小鼠肌肉注射后可诱导轮状病毒特异性血清IgG和IgA。Siadat-Pajouh等[53]利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备出轮状病毒2/6病毒样颗粒(2/6-VLPs)，小鼠经口或鼻腔免疫后均可产生IgA、IgM和IgG。Molinari等人在果蝇幼虫体内合成了RV2/6 VLP，大大降低了生产成本。Rodríguez-Limas等人首次利用酵母作为表达系统，通过采用不同分子和工艺来生产具有复杂结构的RV病毒样颗粒[54]。2016年由诺如病毒样颗粒和杆状病毒-昆虫细胞表达系统产生的重组RV VP6蛋白组成联合疫苗，用于儿童急性轮状病毒性腹泻。相关试验表明，这两种成分均能诱导强烈的免疫应答，并且RV VP6蛋白在体内对诺如病毒特异性抗体反应具有免疫佐剂作用，并在体外促进抗原提呈细胞的激活和成熟[55-58]，使得该疫苗达到一举两得的效果。但该疫苗只在小鼠、家兔和猪模型中评估了其免疫原性、有效性和安全性，尚未进行人体试验。

3.4P2-VP8-P[8]重组亚单位疫苗 P2-VP8-P[8]由截短的RV VP8*(P[8])蛋白融合破伤风毒素的P2 CD4+表位重组表达的一种非复制型轮状病毒疫苗[59-60]。2016年Groome等[61]评估了不同剂量的P2-VP8-P[8]亚单位轮状病毒疫苗的安全性和免疫原性。在528名婴儿中，实验组(99%～100%)抗P2-VP8 IgG血清对P[4]、P[6]和P[8]抗原的应答均高于安慰剂组(10%～29%)，P2-VP8-P[8]疫苗在婴儿中具有良好的耐受性和免疫原性，接种疫苗的婴儿表现出较强的IgG反应，为欠发达地区提供了一个轮状病毒候选疫苗，解决口服疫苗在这些地区免疫效力低的问题。更重要的是，P2-VP8-P[8]亚单位疫苗可以与其他常规婴幼儿计划免疫疫苗，如DTP、IPV、HBV等制备成联合疫苗，简化免疫程序、减少注射次数。

3.5灭活轮状病毒疫苗(IRV) IRV是一种肠外给药的灭活轮状病毒疫苗，该候选疫苗基于G1P[8]毒株，已在小鼠、大鼠、兔和猪模型中试验，显示出较好的免疫效果和保护作用。在进行注射或微针贴片给药后，小鼠除了产生强烈的血清抗体外，还可诱导肠黏膜免疫[62-64]，是实现轮状病毒全球免疫最有希望的候选疫苗。

3.6轮状病毒反向遗传系统 2017年，Kanai等[65-66]研发了完全基于质粒的轮状病毒反向遗传系统，并不断优化，开始在结构功能、病毒复制研究和抗病毒药物的筛选中进行探索。将人轮状病毒基因组拯救出活病毒，与轮状病毒基因融合构建外源基因表达，获得一种安全的减毒重组轮状病毒，在实验中可以对该系统进行严格控制，为开发下一代安全的轮状病毒疫苗提供了条件。然而，该系统的工作机制仍不清楚，评估这些方法取得成功的潜力还为时尚早。

4 展望和结论

近年来对轮状病毒的研究已经取得了一定进展，但是轮状病毒的血清型亦不断增加；在疫苗研发方面也处于快速发展时期。基于疫苗安全性及制造成本考虑，近年来研究人员逐渐开始转向非复制型疫苗，但非复制型疫苗也存在不足，需要进一步优化生产工艺，以改善其免疫保护水平，并在将来替代传统的减毒活疫苗。随着研究的深入，相信在不久的将来轮状病毒疫苗开发技术会更加成熟，新型疫苗也将更安全、高效、价廉。

利益冲突：无