m6 A RNA甲基化修饰与肿瘤关系的研究进展

董晓沛综述，康小红审校

0 引 言

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是真核信使RNA(messenger RNA，mRNA)中最常见的内部转录修饰，m6A修饰最早于20世纪70年代被发现，因技术瓶颈，该领域的发展非常缓慢，2011年，肥胖相关蛋白(fat-mass and obesity associated protein，FTO)被报道具有m6A去甲基化酶功能，并证明m6A修饰是动态可逆的，该领域才得以复兴[1]。迄今为止，科学家们总结了m6A的相关修饰是由甲基转移酶复合体(METTL3、METTL14和WTAP组成)、去甲基酶(FTO和ALKBH5)以及相应的阅读器(YTHDF1/2/3，YTHDC1)协同调控，并将其依次归类为“书写者(writers)”，“擦除者(erasers)”和 “阅读者(readers)”。m6A修饰几乎参与mRNA所有的代谢过程，如成熟、转运、剪接、翻译和降解等[2]。近年来大量研究证实m6A RNA甲基化在哺乳动物中具有重要的生物学功能，如组织发育、昼夜节律、DNA损伤反应、性别鉴定和肿瘤的发生、发展等[2]。本文主要就m6A在肿瘤进展中的潜在作用作一综述。

1 m6A mRNA甲基化概述

m6A修饰是指在腺甘酸的N6位置上添加一个甲基基团，是进化上保守的RNA修饰。研究发现在mRNA中约有0.1%-0.4%的腺苷酸受到m6A修饰，平均每个转录本有2-3个m6A修饰位点，m6A主要发生在RRACH序列中(其中R=A或G，H=A，C，或U)，在终止密码子、3′非翻译区(3′ultranslated region，3′UTR)、和内部长外显子聚集[3]，从而影响RNA转录，加工，翻译和代谢。m6A修饰受到m6A调节酶的控制，其中甲基转移酶作为m6A“书写者”积极催化这种修饰，而具有脱甲基酶活性的m6A“擦除者”可消除m6A修饰，m6A“阅读者”识别修饰的残基并传达信息，从而建立高效且有序的m6A调节网络。

甲基转移酶复合物主要由甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、METTL14和肾母细胞瘤1-相关蛋白(Wilm＇s tumor 1-associated protein，WTAP)组成，协同调控m6A的分布，METTL3为核心组分，METTL14与METTL3结合为稳定的异二聚体，并通过协同效应催化m6A RNA甲基化，WTAP将METTL3- METTL14复合物锚定在靶RNA上，并促进其在核斑点中的积累，由于WTAP不存在甲基转移酶活性，因此该调控亚基在功能性m6A甲基化复合物的前提下发生作用[4]。KIAA1429和RBM15已被确定为M6A“writer”复合体的新组成部分，RBM15有助于将复合物招募到目标位点。KIAA1429的分子功能尚不清楚[5]。METTL16是新定义的靶向U6小核RNA(U6 snRNA)的m6A分子，通过在蛋氨酸饥饿时诱导S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达来调节S-腺苷甲硫氨酸的稳态[6]。

m6A去甲基化酶包括FTO和Alk B同源物5(Alk B homolog 5，ALKBH5)。FTO最初被证明可调节能量稳态，并且与肥胖风险呈正相关[7]。ALKBH5是FTO的同系物，均属于Fe(II)和α- 酮戊二酸依赖性AlkB加氧酶家族。在m6A调节网络中，FTO和ALKBH5将m6A修饰的核RNA识别为底物，并催化m6A甲基修饰的去除[8]。

m6A阅读蛋白可分为三大类：①包含一个进化保守的YTH(YT521-B同源性)结构域的蛋白，该结构域折叠成可直接与m6A结合的疏水芳香结构，人类基因组含有5种YTH结构域蛋白，分别为YTHDFs亚型中的读取基因(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)和YTHDCs亚型中的读取基因(YTHDC1、YTHDC2)，对m6A甲基化mRNA的亲和力是未甲基化mRNA的10-50倍[9]。YTHDFs亚型的蛋白主要在细胞质中分布。②包括三种核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs)，hnRNPC、hnRNPG和hnRNPA2B1，“m6A开关”现象即m6A削弱Watson-Crick碱基对，破坏RNA发夹结构，从而暴露了单链hnRNP结合基序，这些蛋白通过m6A开关选择性地与含有m6A的转录本结合[10]，影响mRNA定位和选择性剪接。③胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1-3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 1-3，IGF2BP1-3)通过K同源域识别GG(m6A)C序列，在正常和应激条件下以m6A依赖的方式增强其靶mRNA的稳定性和翻译[11]。

2 m6A在肿瘤中的作用

2.1 m6A甲基转移酶与肿瘤

2.1.1 METTL3METTL3是RNA N6 -腺苷主要的甲基转移酶，在转录后水平调节癌基因和抑癌基因的表达，包括mRNA的稳定性和翻译过程。在胶质母细胞瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)中，Cui等[12]通过敲低METTL3来阻碍m6A的富集，造成GSCs的生长增强、自我更新和肿瘤的进展。相反，METTL3在人胶质母细胞瘤组织中表达上调，通过与3′UTR中的SOX2 mRNA结合，诱导m6A修饰，沉默METTL3可抑制SOX2的表达，增强肿瘤细胞对γ辐射的体外敏感性，抑制小鼠胶质母细胞瘤肿瘤生长，从而发挥致癌作用[13]。以上争议的原因可能与m6A标记不同的靶mRNA，癌症干细胞的遗传和非遗传异质性有关。此外，研究表明METTL3在人肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[14]、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)[15]和多发性实体瘤中均显著上调，METTL3过表达与患者预后不良有关，敲低或敲除METTL3可显著减少癌细胞的增殖和迁移，通过多种机制影响 m6A 修饰发挥促癌作用。在胰腺癌细胞中，METTL3的敲低对细胞增殖无影响，但会提高细胞对吉西他滨，5-氟尿嘧啶，顺铂和放射线等抗癌药物的敏感性[16]。在膀胱癌中，METTL3通过识别DGCR8(Di George cirtical region 8)来加速pri-miR221 /222的加工，成熟的miR221 /222抑制了抑癌基因PTEN的表达，并促进肿瘤生长[17]；在皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)中，上调METTL3促进了Np63的表达，从而促进CSCC细胞的增殖和肿瘤的生长[18]。

2.1.2METTL14METTL14作为癌基因或抑癌基因在特定肿瘤中发挥着不同的作用，为与m6A修饰甲基转移酶相关肿瘤药物的研发提供了思路。①抑癌作用，与胶质母细胞瘤中 METTL3一样，METTL14敲低后促进了恶性表型，表现为癌基因(如ADAM19)表达的上调和抑癌基因(如 CDKN2A)表达的下调[12]。同时，子宫内膜癌中METTL14功能的缺失突变会减弱m6A的甲基化，通过激活AKT通路增强子宫内膜癌的细胞增殖和致瘤性[19]。在肝癌组织中m6A修饰被抑制，而METTL14下调提示无复发生存差， METTL14以m6A依赖性方式正向调节pri-miRNA126，抑制癌转移[20]。这一结果与Chen等[14]在原发性肝癌组织中发现的m6A显著升高、METTL3过表达后通过m6A-YTHDF2依赖性SOCS2 mRNA降解而促进肝癌发生的结论相反。而争议可能归因于复杂因素，包括用于分类mRNA转录物的不同阅读器蛋白质，以及不同的肿瘤样本和m6A检测方法。②致癌作用，在造血干细胞和AML细胞中，METTL14过表达后发挥致癌作用，其机制是通过m6A修饰对MYB和MYC mRNA的稳定性和翻译的积极调控[21]。这一结果与AML中METTL3的影响部分重叠，可用IGF2BPs介导的替代阅读过程来解释。

2.1.3WTAP在肝癌[22]癌组织中，WTAP过表达，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。但是，WTAP对细胞增殖的调控具有细胞类型特异性。在AML中，WTAP支持肿瘤生长，但阻止白血病细胞分化[23]。当WTAP耗竭后，采用依托泊苷治疗可使急性髓性白血病干细胞凋亡程度明显增加[23]。最近有研究发现，在结直肠癌中，碳酸酐酶IV通过靶向WTAP- WT1- TBL1轴抑制Wnt信号通路[24]。综上，WTAP在癌症的治疗中可起到重要的作用，但对其分子机制的了解并不深入，需要进一步研究。

2.1.4METTL16METTL16是新定义的m6A的“书写者”，关于其在肿瘤中的作用机制研究相对较少。最近Liu等[25]使用TCGA、GEO和HPA数据库以及组织芯片(TMA)队列验证了METTL16在结肠腺癌中高表达，且METTL16表达与患者预后密切相关，但其分子机制并不清楚。

2.1.5KIAA1429在乳腺癌组织中，KIAA1429通过m6A独立的方式调节细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)，促进癌细胞的增殖和转移，而5′-氟尿嘧啶对降低乳腺癌KIAA1429和CDK1的表达非常有效[26]。Cheng等[27]研究发现KIAA1429在肝癌细胞过表达并促进癌细胞的侵袭，KIAA1429的下调抑制了DNA 结合抑制因子2 mRNA的m6A修饰。以上研究均证实了KIAA1429在肿瘤中的致癌作用，并发现了KIAA1429的有效抑制剂，说明KIAA1429可能是一种有前途的肿瘤治疗靶向因子。

2.2m6A去甲基化酶与肿瘤

2.2.1 FTOFTO作为第一个被发现的m6A去甲基化酶，在肿瘤的发生、发展和化疗耐药中起着重要作用。Li等[28]发现FTO在AML中高表达，并促进肿瘤细胞的增殖，FTO通过抑制一组关键转录本(如ASB2和RARA)的表达来发挥其致癌作用，从而抑制全反式维甲酸诱导的t(15；17)AML细胞向粒细胞分化。因此，利用靶向的FTO信号抑制因子结合全反式维甲酸治疗白血病可能成为一种有效的治疗策略。FTO是R-2-羟基戊二酸盐(R-2HG)的直接靶点，Su等[29]发现R-2HG通过抑制FTO而促进m6A在MYC和CEBPA转录本上的积累，降低其mRNA的稳定和表达，抑制AML进展。同时，R-2HG与地西他滨、柔红霉素等一线化疗药物也有协同作用，并在小鼠模型中得到验证。Cui等[12]研究表明，FTO在胶质母细胞瘤中具有促癌作用，其抑制剂MA2是甲氯灭酸(MA)的乙酯形式，可增加GSCs中的mRNA m6A修饰水平，抑制GSC的生长。研究发现，FTO促进黑素瘤的致瘤性和抗程序性死亡受体1(anti-PD-1)阻断的反应。FTO敲低增加了致癌基因(包括PD-1，CXC趋化因子基序受体4和SOX10)的m6A甲基化，导致通过阅读器YTHDF2引起的RNA衰减增加。FTO敲低亦可降低黑色素瘤对γ干扰素的敏感性，进而对小鼠的抗PD-1治疗产生敏感性[30]。以上均说明了FTO的致癌作用，然而作为抑癌因素，FTO的蛋白水平在肝内胆管癌中下调并降低细胞凋亡，对顺铂治疗产生耐药性[31]。在透明细胞肾癌中，FTO的mRNA水平降低与肾切除术后总生存率降低有关[32]。

综上所述，FTO在肿瘤中发挥双向调节作用。FTO抑制剂(大黄酸、2OG类似物、恩他卡朋、FB23-2、MA2、R-2HG)的发现预示了FTO可能成为肿瘤治疗和药物开发的潜在分子靶点，但其抑制剂在人体内的药物作用还需要被深入证实。

2.2.2ALKBH5与BRCA突变的上皮性卵巢癌中的FTO相似，ALKBH5的表达也受到抑制，通过稳定FZD10 mRNA激活Wnt /β-catenin途径，使细胞对奥拉帕尼(Olaparib)产生抗性[24]。ALKBH2为ALKBH蛋白质家族中的一个亚型，用其构建的RNAi慢病毒载体为进一步研究ALKBH2沉默后相关的泌尿系肿瘤生物学功能的影响提供稳定、高效、可靠的技术平台[33]。ALKBH5发挥致癌作用，在胶质母细胞瘤干细胞中[34]，ALKBH5高表达，通过调节癌症干细胞功能，促进癌细胞的增殖和转移。新近研究发现，ALKBH5可特异性的促进AML的进展以及白血病干细胞的自我更新，而对正常造血及血液细胞的自我更新影响很小[35]。在胰腺癌中，ALKBH5则发挥抑癌作用，ALKBH5造成lncRNA KCNK15-AS1脱甲基化，从而抑制胰腺癌细胞的转移[36]。

2.3m6A结合蛋白与肿瘤

2.3.1 YTHDF1在人结肠癌组织中，c-Myc癌蛋白可促进YTHDF1基因表达，诱导癌细胞增殖并对氟尿嘧啶和奥沙利铂产生耐药性[37]。YTHDF1可识别溶酶体蛋白酶m6A标记的转录本，并促进抗原的降解，被吞噬的新抗原的交叉呈递和CD8+T细胞的交叉表达被抑制，从而导致免疫逃逸和肿瘤的不完全消除[38]。在眼黑色素瘤中，YTHDF1促进了含有m6A的HINT2 mRNA(一种肿瘤抑制剂)的翻译[39]。在NSCLC中，常氧条件下，YTHDF1的耗竭会导致m6A标记的转录物翻译效率降低，抑制肿瘤的生长并导致癌细胞对顺铂耐药；在化疗应激条件下，YTHDF1 耗竭会导致 m6A修饰的Keap1的翻译减少，从而上调Nrf2和AKR1C1(活性氧的清除系统)[40]。这些相反的结果突出了在正常和应激状态下实现YTHDF1表达及其目标稳态的重要性。

2.3.2YTHDF2在HCC中，YTHDF2减少可引起炎症和血管重建，促进肿瘤的进展。此外，应用靶向HIF-2α并恢复YTHDF2表达的小分子抑制剂PT2385，可提高体内外治疗HCC细胞的效果[41]。Chen等[42]发现在胰腺癌临床样本中，YTHDF2表达上调，YTHDF2通过破坏酵母相关蛋白mRNA的稳定，促进胰腺癌细胞系的增殖并抑制其迁移和侵袭，这一现象被称为胰腺癌细胞中上皮-间质转化的“迁移-增殖二分法”。在前列腺癌中，miR-493-3p诱导YTHDF2表达下调，促进细胞的增殖和迁移[43]。Paris等[44]报道YTHDF2缩短了m6A修饰的TNF受体2(TNFR2)mRNA的半衰期，而后者通常阻止白血病细胞的积聚，从而促进AML的扩散。以YTHDF2为靶点不仅能根除白血病干细胞，还能扩增造血干细胞以增强骨髓重建。因此，YTHDF2抑制剂在AML中的治疗前景将非常可观。

2.3.3YTHDF3LncRNA GAS5增强YAP磷酸化、泛素化和降解，削弱YAP信号，抑制结直肠癌细胞增殖和转移，而YTHDF3识别m6A修饰的GAS5并诱导其衰变[45]。不同睾丸生殖细胞瘤(testicular germ cell tumors，TGCT)亚型间m6A丰度和VIRMA/YTHDF3表达存在差异，在精原细胞瘤中，YTHDF3和VIRMA的表达均上调，它们之间存在正相关[46]。这一发现为鉴别TGCT亚型提供了新思路。

2.3.4YTHDCs结合蛋白(YTHDC1、YTHDC2)与肿瘤关系的研究非常少，最近几年进展缓慢。YTHDC1 的异常表达可调节癌组织选择性剪接[47]。在结肠癌组织中，YTHDC2 的表达与肿瘤的分期呈正相关[48]。YTHDC2通过解开编码转录因子HIF-1α和Twist1的mRNA的5′-UTR而促进两者的翻译，HIF-1α通过Twist1促进上皮-间质转化，诱导肿瘤转移。

2.3.5IGF2BPIGF2BPs在正常和应激条件下均可增强 mRNA的稳定性和翻译，这会导致MYC等致癌产物的积累，在宫颈癌和肝癌细胞中敲除IGF2BP可抑制细胞的增殖和侵袭[49]。IGF2BP1以m6A依赖性方式破坏卵巢癌和肺癌中miRNA定向的miRNA降解并维持血清反应因子的表达，最终上调致癌驱动因子PDLIM7和FOXK1的表达[50]。在转移性黑色素瘤中，螯合物1/ SQSTM1 / p62(p62)的表达较高，与患者不良预后相关。p62通过与IGF2BP1相互作用增强FERMT2和其他促转移因子的稳定性[51]。IGF2BP2可介导结直肠癌的肝转移。在机制上，circNSUN2的m6A修饰被YTHDC1识别，在细胞质中形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2三元复合物，促进HMGA2 mRNA稳定性[52]。IGF2BP3具有致癌特征，在胰腺癌中高表达，与患者不良预后有关[53]。

3 结 语

m6A修饰的“书写者”，“擦除者”和“阅读者”在调节RNA代谢、干细胞自我更新、免疫应答和各种癌症转移方面都起到重要作用。毫无疑问，m6A甲基化在开发全新的人类癌症疗法方面具有巨大潜力。但仍然存在许多挑战。第一：m6A调节剂在某些癌症中的机制尚不清楚，尤其是m6A修饰的“阅读者”相关研究更少；第二：许多研究表明，m6A调节剂和相关途径可以用作治疗靶标，但是在临床实践中由于样本量大，缺乏特定的应用，而且相应的副作用在很大程度上还不清楚；第三：m6A修饰蛋白具有抑癌或致癌的双重作用，许多争议性的研究结果有待进一步探索其具体原因。当然，在下一代测序的时代，轻松生成和分析大数据(组学)是可能的，这将进一步扩展和变革癌症生物学，为解决以上问题提供条件。