背根神经节在药物神经毒性体外评价中的应用

王美婷，赵 琪，张艺哲，邢红艳，汪溪洁

（中国医药工业研究总院，上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203）

药物诱导的严重神经毒性是导致新药研发失败的原因之一。由于动物模型在药物神经毒性评价和机制研究等方面存在诸多不足，如种属和遗传背景差异大、周期长和费用高，药物神经毒性研究的模型逐渐从体内动物模型向体外细胞模型转变［1］。背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元接收机体的感觉信息并向脊髓传递，已作为体外细胞模型广泛应用于药物神经毒性研究。随着细胞重编程和干细胞分化技术的发展，人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSC）分化和成纤维细胞重编程的DRG神经元在药物神经毒性研究的应用也开始备受关注［2］。本文综述不同来源的DRG神经元体外模型的特点，以及采用DRG神经元开展药物神经毒性体外评价的最新进展。

1 背根神经节概述

DRG来源于神经嵴的前体细胞，属于外周感觉神经节，其中的DRG神经元为假单极神经元，由多种感觉神经元亚型组成，具有将疼痛、温度和压力等感觉刺激信号向中枢神经系统传递的功能。根据形态和功能的不同，DRG神经元可分为伤害性神经元和非伤害性神经元［3］。

1.1 伤害性神经元

伤害性DRG神经元支配上皮和肌肉等组织，能对疼痛、瘙痒和温度变化等刺激做出反应［4］。伤害性神经元直径较小，多为无髓C纤维感觉神经元和薄髓Aδ纤维感觉神经元，表达原肌球蛋白相关激酶A（tropomyosin-related kinase A，TrkA），对神经生长因子具有高亲和力，释放谷氨酸作为主要的神经递质，可进一步分为肽能神经元和非肽能神经元［5］。肽能神经元释放P物质和降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）等神经肽，而非肽能神经元则主要表达同工凝集素B4（isolectin B4），同工凝集素B4可特异性地与传递伤害性刺激信号的周围感觉神经元相结合［6-7］。

1.2 非伤害性神经元

非伤害性DRG神经元主要分为本体感受和机械感受2种类型。本体感受型神经元由厚髓Aα和Aβ纤维组成，传导速度很快，可感知肌收缩和肢体位置［8］，平衡感觉和运动，表达TrkC，可被神经营养因子3激活［9］。大部分投射到皮肤的表皮和真皮区域的非伤害性DRG神经元是机械感受型，其通过特有的感觉神经末梢传导机械刺激信号［8］。机械感受型神经元由厚髓Aβ纤维组成，以表达TrkB为特征，对脑源性生长因子（brainderived growth factor）具有高度亲和力，支配皮肤组织并传递皮肤的触觉和振动刺激信号等非伤害性刺激信号［10］。

2 背根神经节体外模型来源

DRG神经元是感觉信息传入的初级神经元，目前研究中所采用的DRG神经元可直接来源于啮齿类动物、非啮齿类动物和人，也可间接来源于成纤维细胞和人多能干细胞。

2.1 直接来源的背根神经节神经元

2.1.1 啮齿类动物

啮齿类动物DRG神经元来源广泛，是研究基本的信号通路、神经网络和疾病发生机制的重要工具［11］。然而啮齿类动物与人类遗传背景不同，其实验数据外推至人的可靠性有限，因而探讨啮齿类动物DRG神经元与人类DRG神经元之间的差异和相似性尤为重要［12］。Rostock 等［13］观察到，TrkB 和TrkC在人和小鼠的DRG神经元中的表达相似，而TrkA和瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）在人和小鼠DRG神经元中的表达存在显著差异。Li等［14］发现，约46%小鼠DRG神经元表达重多肽神经丝蛋白（neurofilament heavy polypeptide），而 97.3% 人DRG神经元表达［13］。与人DRG神经元相比，啮齿类动物DRG神经元Nav1.8通道表现出更快的失活动力学、更小的电流以及更低的神经元放电频率［15］。此外，人DRG神经元大多可同时表达CGRP和P2X3受体，而小鼠DRG神经元则只能表达单一受体［16］。因此，研究者采用啮齿类动物模型研究这些指标时，应格外注意种属差异对实验结果产生的影响。

2.1.2 非啮齿类动物

当前，犬、兔和猴等非啮齿类动物来源的DRG神经元研究较少，在某些方面，非啮齿类动物DRG神经元与人DRG神经元更相似，如犬DRG神经元中神经节苷脂的新陈代谢与人DRG神经元中的更相似［17］。有研究表明，对于一些神经系统疾病比如莱姆病（Lyme disease），伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）在恒河猴中的感染与人类莱姆病的早期传播相似，因此恒河猴DRG神经元是研究莱姆病发生机制及防治的经典模型［18-19］。此外，犬DRG神经元对辣椒素和异硫氰酸烯丙酯（allyl-isothiocy⁃anate）比啮齿类动物DRG神经元更敏感，表明啮齿类与非啮齿类动物DRG神经元之间存在差异［20］。相较于啮齿类动物，非啮齿类动物因寿命更长、环境暴露和自发的疾病情况与人类更接近等因素，在药物神经毒性等研究中转化为临床研究更具有优势［20］。

2.1.3 人类

实验室很难获得人外周神经组织，不仅是因为DRG中含有许多感觉神经元，在传递疼痛信息方面发挥重要作用，很难甚至不可能从活体获得DRG神经元，且还涉及伦理问题［13］。Davidson等［21］研究发现，中小型DRG神经元动作电位持续时间长，可能是由钙和钠通道内流引起，且人DRG神经元中的大多数神经元可对异硫氰酸烯丙酯、组胺和氯喹等致敏原产生反应。电压门控钠离子通道在DRG神经元动作电位的产生中具有关键作用。Chang等［22］发现，在人DRG神经元中，Nav1.7通道表达约占电压门控钠离子通道表达的50%，而Nav1.8通道表达较低，约占12%。目前应用人DRG神经元的研究数量有限，其替代模型的研究至关重要［23］。

2.2 间接来源的背根神经节神经元

2.2.1 多能干细胞

hPSC是能分化为人体所有细胞类型的干细胞，包括人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESC）和人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）2大类。Alshawaf等［24］对hESC分化的DRG神经元形态和功能研究发现，hESC分化的DRG神经元能够表达感觉神经元标志物大脑-特定同源框/POU结构域蛋白3A（brain-specific homeobox/POU domain protein 3A）和ISL LIM同源框蛋白1（ISL LIM homeo⁃box 1），分化后约12 d开始出现自发放电，随后放电率（spike rate，SR）继续增加，分化约6周时SR达最大，为（258.2±102.5）-1。然而，由于hESC可能引起伦理争议，近些年一些研究者转向hiPSC的研究并成功分化得到外周神经元［25-26］。Chambers等［27］采用小分子抑制剂组合（SU5402，HIR99021和DAPT等）将hiPSC诱导分化为外周神经元，此后这种方法被许多研究者优化改进，如改变小分子抑制剂的浓度或增加神经营养因子3以提高分化效率，用以开展疼痛体外表型筛选及药物神经毒性评价等研究［28］。当前也有公司推出商业化的hiPSC分化的外周神经元产品，如Ncardia公司的Peri.4U。尽管hPSC分化的神经元可大量获取，但hPSC在分化过程中很可能出现异源细胞，从而影响实验结果，这一点需要引起研究者的重视［29］。

2.2.2 成纤维细胞

除干细胞分化可得到DRG神经元外，成纤维细胞也可直接重编程为DRG神经元。2015年，Blanchard等［30］采用与DRG神经元相关的转录因子将人和小鼠的成纤维细胞直接重编程为DRG神经元，这些神经元具有感觉神经元的形态和电生理活性，并与内源性感觉神经元的特征基因和受体表达一致，如重编程获得的神经元选择性表达Trk。在成纤维细胞重编程过程中，转录因子的选择至关重要。Wainger等［31］从12种候选转录因子中选出5种转录因子 ASCL1，MYT1L，KLF7，NGN1和ISL2用于成纤维细胞的重编程，同时也发现重编程得到的DRG神经元能表达Nav1.8、TRPV1和瞬时受体电位锚蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）等通道。在成纤维细胞重编程的过程中很少出现异源细胞，避免了干细胞分化过程中可能出现的致瘤性问题［3，32］。

2.3 背根神经节神经元体外模型的优势和局限性

早期大部分研究采用的DRG神经元均来源于动物模型，近年来研究更为广泛的为hPSC分化和人成纤维细胞重编程获得的DRG神经元［33］。相较于动物模型，体外间接来源的DRG神经元与人DRG神经元更接近，可著减少实验动物的使用，满足动物福利的要求，有望更好地代替人DRG神经元用于药物高通量筛选、神经毒性评价和疾病模型建立等［28，34-35］。与此同时，间接获得DRG神经元的过程也有一些亟待解决的问题，如分化或重编程方案、外周神经元亚型的轴突髓鞘化以及DRG神经元的分化效率等［25，36］。另一个需要考虑的问题是需要比较体外外周神经元与人DRG神经元的一致性，未来需要继续优化分化或重编程方案以减少两者间的差异［3］。

3 背根神经节在药物神经毒性研究中的应用

由于缺乏有效的屏障保护，以及周围分布的丰富毛细血管，DRG神经元易受到药物诱导的神经毒性损害［37］。目前临床许多药物在发挥治疗作用同时也会引起神经毒性不良反应，其中以抗肿瘤药、镇痛药和麻醉药最多。不同化合物的神经毒性机制不同，在新药研发早期，及时发现候选化合物引起神经毒性的潜在风险至关重要。

3.1 抗肿瘤药

DRG神经元体外模型在抗肿瘤药诱导的神经毒性研究中应用广泛，目前已用于药物高通量筛选、神经毒性评价和毒性机制研究［38-40］。近年来，体外间接获得的DRG神经元备受关注，有研究者采用hPSC分化的神经元评价化疗药物诱导的外周神经毒性（chemotherapy-induced peripheral neuro⁃toxicity，CIPN），并且筛选出具有CIPN风险的抗肿瘤药，降低了临床神经系统不良反应的发生率［41-42］。然而，间接来源的DRG神经元，尤其是重编程获得的DRG神经元，在CIPN机制研究中的应用还比较少，未来还具有很大的研究空间。

Hoelting等［43］应用hPSC分化的DRG神经元模型成功建立了识别外周神经毒性化合物的高通量筛选系统，其中DRG神经元模型的来源以及高通量筛选方法的选择对CIPN高通量筛选具有重要影响。Wing等［44］通过细胞活力、高内涵成像和微电极阵列（microelectrode array，MEA）技术比较hiPSC分化的皮质神经元和DRG神经元对顺铂和硼替佐米等抗肿瘤药的敏感性，结果表明，hiPSC分化的DRG神经元模型用于CIPN评价的敏感性和准确性更高，同时进一步证实了DRG神经元为抗肿瘤药诱发外周神经毒性的靶点。此外，有研究表明，DRG神经元细胞膜上离子通道改变能引起神经元兴奋性增高，而神经元兴奋性增高是CIPN发生的重要机制［45］。Li等［46］发现，紫杉醇可引起大鼠和人DRG神经元中Nav1.7通道表达上调，引起DRG神经元兴奋性增高，从而产生外周神经毒性。此外，CIPN在线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症和胶质细胞等方面也有很多相关机制研究［47-49］。

3.2 镇痛药

有文献报道，DRG神经元是镇痛药发挥作用的关键靶点，对新型镇痛药的研发具有重要作用［50］。DRG神经元表达的Nav1.7通道与疼痛的发生机制密切相关，选择性阻断Nav1.7通道能增加DRG神经元的放电阈值，并引起CGRP递质释放减少［51］。此外，TRPV1和TRPA1通道在DRG神经元中表达较多，炎症和神经损伤会改变DRG神经元内TRPV1和TRPA1的表达和功能，从而产生慢性疼痛［52-53］。目前一些TRP通道拮抗剂已作为镇痛药进行研发，如一些强效的小分子TRPA1通道拮抗剂已进入治疗神经性疼痛的临床试验，TRPM8通道拮抗剂也用于治疗冷触痛［54-55］。除DRG神经元的钠离子通道、TRP通道和炎症反应参与疼痛机制研究外，胶质细胞和交感神经机制也在一定程度上参与了疼痛。目前以DRG神经元为靶点的基因治疗和干细胞疗法在镇痛药研发上已取得一定进展，但仍存在许多挑战，如干细胞的再生、修复和镇痛作用仍不确定［56］。

3.3 麻醉药

全身麻醉药的应用可能会导致患者出现严重不可逆的神经毒性，也会对患者的神经行为造成严重影响。局部麻醉药如利多卡因、罗哌卡因和布比卡因在临床上也可能引起外周神经毒性，已有研究者应用啮齿类动物DRG神经元对局麻药引起的神经毒性进行机制研究［57］。敲除钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱβ亚型基因可保护DRG神经元免受罗哌卡因诱导的神经毒性的影响，提高细胞存活率，减少细胞凋亡，并使T型电压门控钙离子通道的表达下调［58］。另外，Zhang等［59］采用小鼠 DRG 神经元模型探讨肿瘤坏死因子信号通路在布比卡因诱导的神经毒性中的作用，研究发现，肿瘤坏死因子-α对防治麻醉药引起的DRG神经元凋亡损伤具有关键作用。当前已有多种手段可减轻麻醉药诱导的神经毒性，如下调微RNA或应用虫草素等［60］。未来更多不同来源的DRG神经元模型还可用于研究麻醉药诱导的神经毒性，为临床安全用药提供参考。

3.4 其他

上述3类药物在临床上均有明显的外周神经毒性症状，且已有基于DRG神经元模型的毒性评价和机制研究的相关报道，然而有关其他药物的报道很少，可能是因为DRG神经元仅针对于药物诱导的外周神经毒性，对药物诱导的中枢神经毒性不适用。目前仅发现吡哆醇可引起DRG神经元坏死和周围感觉纤维退化，其引起的神经病变的症状与CIPN相似［61］。另外，DRG神经元也已用于一些化合物诱导的神经毒性研究，如研究发现甲基汞对大鼠DRG神经元的外周神经毒性与小胶质细胞/巨噬细胞的增加与施万细胞的增殖有关［62］。

4 结语

DRG神经元是研究药物神经毒性尤其是外周神经毒性重要的体外模型，在药物筛选、毒性评价和机制研究等多方面发挥关键作用。近年干细胞分化和成纤维细胞重编程领域的快速发展，使研究者可获得大量的hPSC和成纤维细胞来源的DRG神经元，为药物神经毒性的研究提供了充足且可靠的体外DRG神经元模型［3］。然而，在体外DRG神经元能完全模拟人DRG神经元之前，仍然存在许多困难，干细胞的诱导分化方案、成纤维细胞的重编程方法以及DRG神经元的纯度仍需不断优化，DRG神经元的应用领域可进一步扩展，药物外周神经毒性机制研究还有待加强。未来还需要增强新型体外神经毒性研究模型的验证，使神经毒性相关指标的研究更加标准和全面，从而更加准确、灵敏地预测候选化合物神经毒性，为后续实验研究和临床试验研究提供参考。