细胞衰老参与特发性肺纤维化分子发病机制的最新研究进展

王 学综述, 任丽君, 张英为, 周玉皆审校

0 引 言

1961年Hayflick和Gil[1]观察发现，当正常人成纤维细胞连续传代时，细胞分裂至一定代数也会发生停滞，并伴随着表型改变，由此细胞衰老的概念第一次被正式提出。细胞衰老分为复制性衰老和过早性衰老，前者与端粒缩短相关，后者与压力应激诱因相关，主要包括线粒体功能障碍、抑癌基因的失活、氧化应激、电离辐射或高氧等，大多数这些诱因导致细胞DNA损伤或染色质结构改变，并且激活DNA损伤修复(DNA damage repair，DDR)反应。通常，衰老细胞更多表达p21、p16、p53等因子并且出现永久的细胞周期停滞，被认为受p53-p21-RB和p16通路的调节[2]。p53表达增加后通过p21上调细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子1A(Cyclin dependent protein kinase inhibitor 1A，CDKN1A)，CDKN1A使得磷酸化Rb蛋白转变为非磷酸化Rb蛋白从而绑定转录因子E2F，细胞增殖周期进入阻滞。细胞周期素依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK)和细胞周期蛋白Cyclin是细胞周期调控中起重要作用的两类蛋白，p16抑制CDK/cyclin复合物活性阻止非磷酸化Rb和E2F分离介导细胞周期永久阻滞。除生长停滞外，衰老细胞还具有衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)，分泌多种促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和金属蛋白酶，以旁分泌和自分泌的方式参与细胞的生理病理过程[3]。细胞衰老与细胞代谢改变也有关，β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，SA-β-gal)在衰老细胞中表达上调。

1 细胞衰老的主要发生机制

众多研究者发现多种因素均参与细胞衰老的发生。20世纪70年代端粒缩短与细胞“末端复制问题”的联系首次被发现[4]。随后，多种研究证实端粒缩短可导致细胞DNA末端暴露引发DDR，细胞进入衰老周期[5-7]。1989年Linnane等[8]发现由于线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)的修复机制有限，mtDNA会发生突变和缺失，是参与细胞衰老发生的主要靶标。进一步研究显示，线粒体功能障碍还可导致细胞内线粒体活性氧(Reactive oxygen species, ROS)持续增加，使得mtDNA突变积累、氧化磷酸化、抗氧化防御能力受损加重DDR，增加细胞衰老的程度[9-10]。20世纪90年代，科学家纷纷探索细胞衰老与癌症之间的关系，发现抑癌基因失活后可使下游细胞DNA损伤、基因表达以及染色质结构的变化，还可激活细胞增殖阻滞通路，从而引起细胞衰老[11-12]。2007年He等[13]发现DNA损伤和致癌应激还以p53依赖性方式强烈诱导miR-34a、miR-34b和miR-34c的表达，当miR-34过表达时，细胞进入衰老阶段。随后，深入研究显示miRNA家族在控制和参与细胞衰老中均起着重要参与作用，且miRNA表达降低可减弱p53介导的细胞衰老[14-15]。近期，电离辐射(Ionizing radiation，IR)诱导细胞衰老的观点得到众多学者的认同。已有研究表明，IR一方面会导致肿瘤细胞DNA受损，抑制肿瘤细胞的增殖；另一方面，IR可诱导周围正常细胞衰老，导致正常组织纤维化和器官功能障碍[16-19]。同时IR刺激免疫系统迅速消除这些衰老细胞，如果衰老细胞产量超过免疫系统清除能力或免疫系统受损而无法有效清除这些衰老细胞，则衰老细胞会积累[20-21]。

2 细胞衰老参与特发性肺纤维化的发生机制

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性、不可逆和致命的进行性纤维化间质性肺疾病，约占所有间质性肺疾病病例的20%[22]。其病理特征是肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells，AEC)反复被破坏引发弥漫性肺间质纤维化，间质组织瘢痕化增厚，病因和发病机制不明[23]。患者可表现为咳嗽、气喘、呼吸困难，最终呼吸衰竭、甚至死亡。IPF在诊断后平均中位生存期为3～5年[24]。现有证据表明，IPF的发生率和患病率随年龄上升成倍增长，是一种与衰老相关疾病[25]。然而，年龄相关的IPF易感性背后的机制仍不十分清楚，有待深入研究。

2.1端粒缩短参与IPF的发生IPF与端粒缩短有关，短端粒会导致染色体末端暴露，机体识别为DNA双链断裂并激活DDR[26]。研究人员基于PCR测量端粒长度和总胶原含量，与正常对照组相比，IPF患者中端粒长度缩短了约27%，总胶原含量却大幅增加。在有遗传性端粒功能障碍的小鼠中，对博来霉素(Bleomycin，BLM)诱导的染色体损伤及肺纤维化表现有更高的敏感性[27]。人端粒结合因子TRF1(Telomere repeat binding factor 1，TRF1)为一种重要的端粒庇护蛋白。Ram等在小鼠II型AEC中发现，TRF1缺失会导致端粒缩短和肺重构，其特征在于肺泡间隔增厚、结构变形、间质胶原沉积、羟脯氨酸含量增加以及衰老相关SA-β-gal在肺泡上皮细胞中积累加剧。研究显示II型AEC中TRF1的缺失导致肺纤维化的自发发展。ZCCHC8是脊椎动物的一种含锌关节蛋白，可调节端粒酶3'末端成熟。研究人员通过全基因组连锁分析发现肺纤维化家庭中ZCCHC8的突变体(ZCCHC8部分丢失和完全丢失的两种不同的RNA)失调性表型均发展为端粒酶RNA功能不全，导致端粒长度缩短。同时，他们还发现在8%～15%家族性IPF和其他11.3%IPF患者体中端粒酶有关的基因发生突变[28]。综上所述，端粒缩短与IPF发生关系紧密。

2.2抑癌基因的下调参与IPF的发生Tian等[29]研究了IPF患者肺组织中PTEN/NF-κB的活化与细胞衰老之间的关系。结果表明，在纤维化肺组织AEC中PTEN基因表达降低，NF-κB活化和衰老标记增加。体内实验显示，在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，衰老标志物与SASP表达水平增加，NF-κB被激活，PTEN显著降低，上调PTEN基因的表达可延长小鼠的寿命，其下调可加速小鼠衰老。基于上述结果，作者认为，PTEN /NF-κB途径控制AEC衰老，PTEN /NF-κB途径失调可能是AEC衰老参与肺纤维化发生的机制之一。PTEN负调控的蛋白激酶B (Protein Kinase B, PKB/AKT)信号通路对细胞生长和细胞存活的调控起着至关重要的作用。Qiu等[30]在动物模型中发现PTEN的下调激活了AKT通路导致小鼠AEC衰老，而抑制AKT的活性可显着减轻小鼠体内AEC的衰老和肺纤维化程度。该结果表明，由PTEN / Akt途径调节的衰老AEC可能促进了肺纤维化的发生。

2.3线粒体功能障碍参与IPF的发生Zank等[31]人发现线粒体产能过程受过氧化物酶体增殖物激活的受体-γ复合物1α/β(PPARγcoactivator-1α/β，PGC-1α/β)控制。研究发现IPF患者和纤维化小鼠肺中PGC-1α表达均降低且缺乏PGC-1α的小鼠更易受博来霉素诱导的肺纤维化的影响。此外，一磷酸腺苷活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase ，AMPK)是PGC-1α/β的上游激活物，随年龄的增长AMPK以及线粒体功能调节因子活性受抑制，引起线粒体生物发生能力降低。这些结果均说明线粒体功能障碍可能是机体患IPF的因素之一。同时，Schuliga等[32]人通过荧光染色发现在IPF患者肺成纤维细胞中存在线粒体超氧化物、细胞ROS、线粒体DNA、应激水平均升高等线粒体功能障碍表现，该研究结果显示线粒体功能障碍与IPF发生确有相关性。

PTEN诱导的激酶1(PTEN induces putative kinase 1，PINK1)在维持线粒体的形态和功能发挥重要作用。Marta等[33]人将PINK1缺失小鼠与WT小鼠进行图像和形态比较发现PINK1缺失小鼠出现线粒体肿大、线粒体异常百分比增加、线粒体数量减少等现象且小鼠气道周围胶原沉积增加。在进行气管内滴注博来霉素建立肺纤维化模型时发现，相较于对照组，PINK1 缺失小鼠胶原蛋白沉积度、肺纤维化程度、TGFβ的转录水平均更高。由此可知，线粒体功能障碍会影响IPF的发展。

2.4辐射参与IPF的发生IR会损伤接受胸腔放射治疗肺癌患者的II型肺泡上皮细胞(Type II alveolar epithelial cells，AECII)，随着辐射持续存在，AECII损伤耗竭，再生能力下降引发细胞衰老，当辐射再次发生时易导致肺纤维化的发生。Chen等[34]将小鼠肺组织暴露于可诱导纤维化剂量的辐射后发现，衰老的AECII刺激促炎细胞因子释放，其将巨噬细胞、淋巴细胞募集到损伤部位产生多种细胞因子、趋化因子，放大炎症反应并触发成纤维细胞的增殖和募集，一旦成纤维细胞被激活，就会转化为肌成纤维细胞，从而分泌细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)蛋白。当辐射持续存在时，ECM产生过量，受损组织不断重塑，辐射诱发的肺纤维化就会发生。

2.5其他因素参与IPF的发生

2.5.1 IL-18参与IPF的发生以往研究发现，在BLM诱导小鼠IPF模型中，IL-18表达升高，加入IL-18结合蛋白(Interleukin 18 Binding Protein，IL-18BP)后，小鼠肺中胶原蛋白沉积量、TGF-β1含量、α-SMA含量均降低，小鼠肺纤维化程度减轻且存活率提高[35]。该结果提示IL-18参与IPF的发生。同时，其他研究人员在肺纤维化小鼠体中分别分离了接受和未接受IL-18BP治疗的小鼠原代肺成纤维细胞。结果显示，未接受IL-18BP治疗的小鼠肺成纤维细胞中SA-β-gal阳性细胞、P21及P53的含量均增加，而经IL-18BP处理后含量均明显减少。研究结果表明，IL-18BP通过结合IL-18因子阻碍小鼠肺成纤维细胞的衰老和肺纤维化的发生[36]。

2.5.2纤溶酶原激活剂抑制剂-1(plasminogen activator Inhibitor-1，PAI-1参与IPF的发生研究发现，AECII衰老与IPF的发生相关，在IPF中AECII内PAI-1表达出更高的水平[37]。Jiang等[38]向PAI-1特异性敲除小鼠和WT小鼠注射BLM建立小鼠肺纤维化模型。研究发现，与WT小鼠相比，敲除小鼠体重、胶原蛋白、羟脯氨酸、原胶原1α1/2、α-SMA的表达均降低，小鼠肺纤维化程度减弱。该研究揭示，PAI-1的缺失保护小鼠免于博来霉素诱导的肺纤维化影响，PAI-1可能是IPF发生的相关机制之一。

2.5.3MicroRNA(miRNA)参与IPF的发生MiRNA是一类新发现的内源性非编码RNA分子,能在转录后水平调控基因的表达。有报道称miRNA在细胞增殖、发育、分化、凋亡、代谢、信号转导以及IPF发生中发挥重要的调节作用[39]。Cui等[40]发现20月大老龄和10周大幼龄miR-34a消融小鼠对博来霉素诱导的肺纤维化反应不同。与老龄WT小鼠相比，老龄miR-34a消融小鼠肺纤维化程度、肺中胶原蛋白、α-SMA、纤连蛋白含量与WT小鼠相比均降低。此外，他们还发现纤维化小鼠肺泡上皮miR-34a的水平在老龄小鼠中上升，并在老龄小鼠的纤维化肺中被进一步诱导增加。然而在幼龄小鼠中发现，幼龄miR-34a消融小鼠与WT小鼠相比出现更严重的纤维化。这些结果表明miRNA参与IPF的发生，且miR-34a消融对幼年和老年小鼠肺纤维化的影响不同。作者推测miR-34a可能与那些公认参与肿瘤发生的调节因子一样，在生命早期对肺部起保护性作用，随着年龄的增长对肺部起有害性作用。同时，最新研究发现miRNA家族其他成员也参与了IPF的发生[41-42]。

2.5.4WNT信号失调与IPF发展相关WNT信号通路具有刺激细胞生长和分化的功能，该通路的异常激活可能引起细胞的异常增殖，进而导致疾病的发生[43]。在此前研究已发现IPF发病机制中存在WNT/β-catenin信号异常激活现象[44-45]。Shi等[46]在IPF患者肺组织中通过RNA序列分析显示，WNT/β-catenin信号通路被激活且TGF-β含量增加，该信号与TGF-β之间的信号交叉对IPF的发展至关重要，阻断WNT/β-catenin通路可引起IPF小鼠肌成纤维细胞、EMT含量降低，小鼠纤维化程度减弱。该研究结果显示WNT/β-catenin信号异常激活与IPF发生相关。

WNT发育通路在胚胎发育中所必须，若在生命后期活跃起来，可能会导致包括肺在内的多个器官发生病变，这一过程称为拮抗多效性或发育漂移。这些多效性效应也可解释WNT/β-catenin信号异常激活在IPF发生中的作用[47]。

3 结 语

细胞衰老指的是细胞增殖能力达到极限，细胞周期进入阻滞。最近研究发现衰老可能是参与IPF发生的重要因素。衰老的细胞通过诱导DNA损伤或染色质结构改变，激活DDR反应，分泌多种促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和金属蛋白酶，以旁分泌和自分泌的方式参与IPF的发生。端粒缩短、抑癌基因的失调、线粒体功能障碍以及辐射是此前被大家所熟知的通过细胞衰老参与IPF的发生发展的途径，近期研究发现PAI-1、MicroRNA、WNT信号也可通过衰老细胞导致IPF。这些机制为我们从发生途径上治疗IPF提供了可能和依据。然而，仍有其他因素可通过细胞衰老参与IPF的发生，其具体发病机制仍需进一步深入探究。