疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症的可能机制与研究进展

朱耐伟，张 昕，霍丹丹，吴 丹，聂为民，黄 磊

2019年12月，中国武汉出现多例不明原因肺炎患者。科学家利用宏基因组测序技术（metagenomic next-generation sequencing,mNGS）对病原体基因进行了检测，证明是由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease-2019,COVID-19）[1]。截至2021年5月18日24时， WHO数据显示全球累计确诊患者163 312 429例，死亡3 386 825例，给世界公共卫生、经济发展和人类健康带来巨大影响[2]。目前，尚无针对SARS-CoV-2的特效抗病毒药物，疫苗接种是当前最有效且经济的防控手段[3]。世界各国采用灭活疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗、蛋白亚基疫苗和mRNA疫苗等技术方法，紧急开展COVID-19疫苗的研发与制备。截至2021年5月14日，全球范围内处于临床前研究的疫苗184种，处于临床研究的疫苗100种[4]。目前已上市的疫苗有灭活疫苗、腺病毒载体疫苗和mRNA疫苗。在疫苗最初的临床试验中，除了罕见过敏反应外，无其他任何影响安全的重大事件报道。迄今为止，在全世界6亿多人接种疫苗后，出现严重不良反应的风险仍然非常低。

然而，随着研究者对大量疫苗接种后随访信息的分析，疫苗相关的自发性肝素诱导的血小板减少症越来越引起关注，其与肝素诱导的血小板减少症（heparin-induced thrombocytopenia,HIT）症状类似，研究人员将其定义为疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症（vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia,VITT）。本文就VITT的可能机制与研究进展作一综述。

1 简 介

根据英国、德国、法国和美国等国家报告的疫苗不良事件，VITT的发生率介于百万分之一至百万分之八[5]。VITT通常发生在接种COVID-19疫苗后5～30 d左右，其主要表现为血小板减少症和血栓形成，血栓常发生在脑静脉窦、门静脉和内脏静脉等部位，造成缺血和出血性等损害。典型的实验室特征包括血小板计数减少（常＜150×109/L）、D-二聚体升高（常＞4000 μg/L）、纤维蛋白原降低以及血小板因子4 （platelet factor 4,PF4）抗体阳性[6]。目前，导致出现VITT的疫苗主要有以下两种：①ChAdOx1 nCoV-19 疫苗，是由牛津大学和阿斯利康公司共同研发的疫苗，其基于非复制型黑猩猩腺病毒载体，表达野生型刺突蛋白（spike protein,S蛋白），能有效诱导出体液免疫反应（中和抗体和IgG）[7]，在I/II期临床试验中，未发现与ChAdOx1 nCoV-19疫苗相关的严重不良事件[8]。2021年2月中旬，首次出现因注射ChAdOx1 nCoV-19疫苗而发生门静脉血栓和肺栓塞并最终死亡的病例。近期，不同研究团队分别发现，部分人群在首次接种ChAdOx1 nCoV-19疫苗后5～24 d，在身体的特殊部位出现血栓形成和血小板减少症症状，尤其是脑静脉窦血栓形成（cerebral venous sinus thrombosis,CVST）和内脏静脉血栓形成，临床表现包括深静脉血栓、肺栓塞、动脉栓塞和血栓性微血管病等[9-14]。②Ad26.COV2.S疫苗，是由强生公司研发的腺病毒载体疫苗，Ad26.COV2.S疫苗是以复制缺陷型的人类26型腺病毒为载体，稳定表达全长S蛋白的疫苗[15-16]。近期其他研究团队也报道了Ad26.COV2.S接种后发生CVST和血小板减少症的病例[17-19]。上述疫苗引发的症状类似于HIT的临床表现，故将其定义为VITT。

2 致病机制

VITT的致病机制尚不清楚，其潜在的可能机制主要有PF4抗体作用、腺病毒载体作用及S蛋白作用3种。

2.1 PF4抗体的作用 PF4是一种带正电荷的血小板蛋白，储存在血小板α颗粒中[20]。PF4可通过电荷依赖的形式与带负电荷的分子相结合，形成具有免疫原性的复合物，刺激机体产生特异性的IgG等抗体[21-22]。抗原抗体复合物与血小板膜表面的受体FcγRIIa相结合，激活血小板后引起血小板聚集，进而发生凝血反应[23-25]。Greinacher等[9]、Schultz等[10]和Scully等[11]研究团队发现发生VITT的患者体内存在高水平的PF4-聚阴离子抗体，加入PF4可增强血小板的活化，提示疫苗接种可能会诱发针对血小板抗原的抗体形成，其中PF4抗体可能是VITT的主要致病原因。其发生机制类似于HIT ，提示免疫反应可能是血栓形成的潜在原因之一[26-27]。

McGonagle等[28]认为，经肌肉注射的腺病毒载体疫苗会造成局部组织的微损伤，引起局部微出血和免疫细胞的活化，导致腺病毒DNA与PF4结合，抗原递呈细胞摄取后，区域淋巴结内的记忆B细胞产生大量抗PF4的自身抗体，从而造成VITT。该模型中DNA的有效载荷（即预先设计的DNA序列和结合物）和损伤部位的PF4可能是关键因素。Greinacher等[9]认为，ChAdOx1 nCoV-19疫苗中的游离DNA可能是患者产生PF4抗体的触发因素。该研究组在先前研究中发现，DNA和RNA与PF4形成的复合物可以诱导产生抗PF4-肝素复合物的抗体，其表现类似于HIT[29]。虽然有研究表明宿主的天然免疫系统可以与腺病毒相互作用，使腺病毒颗粒释放出游离DNA[30-31]，但目前尚不清楚ChAdOx1 nCoV-19疫苗和Ad26.COV2.S疫苗是否存在游离DNA，该机制有待验证。

Sørvoll等[32]对 492 例接种 ChAdOx1 nCoV-19疫苗的健康者检测，仅有6例检测到PF4-聚阴离子抗体，但上述抗体均无血小板活化的特性，受试者并无严重的血小板减少症等临床症状。Thiele等[33]检测了健康疫苗接种者中PF4-聚阴离子抗体发生率，143例接种mRNA疫苗BNT162b2的人群中，8例PF4-聚阴离子抗体检测呈阳性；138例接种ChAdOx1 nCoV-19疫苗的人群中，11例PF4-聚阴离子抗体检测呈阳性，但上述人群的PF4-聚阴离子抗体均不能诱导血小板的活化，表明人群接种mRNA疫苗和腺病毒载体疫苗均可以出现PF4-聚阴离子抗体。此外，有研究表明5%～7%健康献血者也可以检测到低水平的非致病性PF4-聚阴离子抗体[34]。上述研究提示，大多数PF4-聚阴离子抗体与临床无相关性，导致VITT的致病性血小板活化抗体仍是罕见的。

PF4在VITT发病机制中的作用仍不明确，PF4在VITT中是直接激活促进血栓形成还是以PF4-聚阴离子抗体的形式激活血小板仍有待研究。此外，引起VITT的致病性血小板活化抗体是疫苗的炎症刺激诱导的抗PF4自身抗体，还是疫苗与PF4和血小板之间的交叉反应诱导出的抗体，也尚须进一步加以探究和验证。因此，有必要对自然感染后的抗PF4抗体和疫苗接种者深入研究，进一步在体内模型中证明抗PF4抗体导致血栓形成和血小板减少症，可能有助于深入了解VITT的风险及病理生理学机制。

此外，有研究表明经乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）修饰的血小板膜上可产生识别抗原的抗血小板自身抗体，从而导致血小板聚集，引起EDTA依赖性假性血小板减少症[35-37]。因此，疫苗中的其他成分（如EDTA）是否参与VITT的形成，也须要进一步探讨。

2.2 腺病毒载体的作用 研究发现，VITT主要出现在接种ChAdOx1 nCoV-19 疫苗和Ad26.COV2.S疫苗的人群中，但其机制目前尚不明确。上述两种疫苗均以腺病毒为载体，ChAdOx1 nCoV-19疫苗主要是基于黑猩猩腺病毒的载体，来自腺病毒E亚群，使用柯萨奇和腺病毒受体及可能其他分子作为其细胞受体[38]。Ad26.COV2.S疫苗是基于人类腺病毒26型的载体，源自腺病毒D亚群，主要利用CD46作为其细胞受体[39]。两种载体使用不同宿主细胞受体，可能具有不同的系统发育和生物学特性。目前，其他利用相同技术研发的腺病毒载体疫苗是否会引起VITT，还有待进一步证实。Barrett等[40]研究发现，接种ChAdOx1 nCoV-19疫苗后，抗ChAdOx1抗体在第一次给药后的28 d内开始增加，在84 d内保持相对稳定。因此，腺病毒载体疫苗接种后产生的抗载体抗体是否在VITT中发挥作用也不容忽视，须要进一步深入研究。

既往多项研究表明，动物体内大量注射腺病毒可以引起血小板减少症[41-43]，但当前疫苗接种剂量远远达不到动物实验的致病条件。Stone等[44]发现腺病毒5型载体可直接结合并激活血小板，促进血小板与内皮细胞结合，导致微血栓形成。Othman等[45]证实腺病毒5型载体可以激活血小板并诱导形成血小板-白细胞聚合物，同时腺病毒可激活内皮细胞，产生促凝血刺激，导致血小板减少症和血小板功能障碍。目前，ChAdOx1载体和人腺病毒26型载体相关的研究尚处于空白，但仍不能排除腺病毒载体疫苗在某些情况下（如存在PF4抗体的情况下）导致病毒颗粒与血小板结合，从而激活血小板引起相应症状。ChAdOx1 nCoV-19疫苗在BALB/c小鼠的生物分布研究发现，在给药部位的骨骼肌中病毒拷贝数量最高，同时在心脏、肝脏、淋巴结、卵巢和睾丸等组织中也发现了低水平的病毒拷贝[46]。因此，腺病毒载体疫苗在注射部位以外的罕见易位是否会导致其与血小板相互作用也是同样值得探索。

2.3 S蛋白的作用 SARS-CoV-2的S蛋白为三聚体跨膜糖蛋白结构，是SARS-CoV-2感染宿主细胞的关键蛋白，也是COVID-19疫苗研发的主要靶点。其由N端的S1亚基和C端的S2亚基组成，其中S1亚基包含受体结合区域，负责识别和结合宿主细胞受体，S2亚基负责病毒外膜与细胞膜的膜融合[47]。Zhang等[48]研究发现，SARS-CoV-2的S蛋白可以直接活化血小板，并进一步证明是由S1亚基介导活化过程，导致凝血因子释放、炎症因子分泌和血小板-白细胞聚合物的形成，促进了体内血栓的发生。因此，血液中游离S蛋白引起上述反应的可能性在一定程度上存在，但疫苗接种后在血液中是否存在游离形式的S蛋白须在血液样本中进一步验证。

这两款腺病毒载体疫苗编码的S蛋白有所差异。Ad26.COV2.S疫苗编码的是一种经过修饰的融合前构象的S蛋白，其在986位赖氨酸和987位缬氨酸处引入两个脯氨酸突变从而稳定S蛋白的融合前构象，并将682位精氨酸和685位精氨酸分别突变，破坏了Furin蛋白酶切割位点，使得S蛋白无法脱落S1亚基[16]。而ChAdOx1 nCoV-19疫苗编码的是未经修饰的S蛋白，存在S1亚基脱落的情况。S蛋白的差异是否与VITT相关仍有待后续研究。

Almuqrin等[49]通过蛋白质组学发现，ChAdOx1 nCoV-19疫苗感染体外细胞后，可表达多种腺病毒蛋白。目前还不清楚人体接种疫苗后是否也会表达腺病毒蛋白，但对上述现象的探索有助于更好地了解VITT的机制。

3 治疗原则

根据国际血栓和止血学会对VITT的临时治疗指南[50]，目前的治疗方法主要包括静脉注射免疫球蛋白、糖皮质激素、非肝素类抗凝药和血浆置换。治疗上要避免输注血小板（除非患者须要紧急手术）、肝素、低分子量肝素和维生素K拮抗剂，以上药物会加重抗体介导的血小板活化和凝血的发生[11，51]。对疑似VITT的患者应立即给予静脉注射免疫球蛋白（连续2 d，每日0.5～1.0 g/kg），免疫球蛋白可以通过结合Fc受体，抑制血小板的激活[52-53]，恢复患者的血小板计数并降低血液的高凝状态，减少血栓栓塞的风险[54-55]。若患者血小板计数低于50×109/L，则应考虑使用糖皮质激素（如泼尼松1～2 mg/kg）。如果患者血小板计数超过50×109/L且无严重出血，则可以使用非肝素类抗凝药，如磺达肝癸钠、阿加曲班或直接口服抗凝剂阿哌沙班和利伐沙班。当患者通过静脉注射免疫球蛋白和糖皮质激素治疗后，血小板计数仍低于30×109/L或纤维蛋白原水平低于1 g/L，则应考虑早期使用血浆置换或补充纤维蛋白原至1 g/L以上，血浆中的IgG可以抑制抗体对血小板的激活，并在一定程度上纠正低纤维蛋白原血症方面的凝血病[11，56]。

4 总结和展望

截至目前，COVID-19仍然是全世界最严重的公共卫生问题，COVID-19疫苗为人类提供了重要且有效的保护，但VITT问题同样不容忽视。VITT是主要针对ChAdOx1 nCoV-19疫苗，还是所有腺病毒载体的COVID-19疫苗甚至所有COVID-19疫苗，其致病机制又是如何，目前上述问题还须要进一步明确。相信在全世界科学家的共同努力下，VITT致病机理会不断得到阐明，上述机制的明确将对候选疫苗的选择及疫苗安全性提供有力的理论证据，势必会进一步加速全球疫苗接种计划，有效控制全球COVID-19疫情蔓延。