口蹄疫病毒O 型液相阻断ELISA 免疫抗体检测快捷方法

莫荣艳，熊丽文，梁惠娟，黄 钰，黎益图，何 涛，覃 磊

（来宾市动物疫病预防控制中心 546100）

本实验应用液相阻断ELISA 检测方法检测猪血清样品80份，快速检测猪的O 型口蹄疫抗体效价≥1∶64 有多少份。 ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系：猪的抗体效价≥1∶64,99%以上保护；抗体效价＜1∶4，不保护；效价在1∶4～45,50%保护。

1 材料和方法

检测样品：猪血清80 份（样品不能有溶血状态、受污染、破损、变质)，编号为DA1～DA80。

实验器材：酶标仪；37℃恒温箱；超纯水仪；移液器；配套移液枪尖；96 孔U 型微量血凝板；移液槽；吸水纸；检测试剂盒是中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫病毒O 型抗体液相阻断ELISA 检测试剂盒。

2 试剂准备

将口蹄疫病毒O 型抗体液相阻断ELISA 检测试剂盒从冰箱取出，放置常温解冻，试剂恢复常温后使用。 打开超纯水仪，取出2L 超纯水装在容器备用，按照检测试剂盒说明书，配制25倍PBST 浓缩液，用超纯水稀释成1 倍PBST（例如：1mL 浓缩液加入24mL 超纯水）。 打开恒温箱电源，设置温度到37℃，温度上升到37℃才能按实验要求正常工作。 配制口蹄疫O 型病毒抗原：按照抗原配制比例,用PBST 稀释液稀释到工作浓度（1∶25，即1mL 病毒抗原加24mL PBST 稀释液）。

3 实验操作步骤

3.1 稀释血清 80 份血清需要96 孔U 型微量血凝板共5块，在血凝板边缘标记数字（横向标记为1,2-12，纵向标记为A,B-H），一块板可以稀释16 份血清样品。例如编号为DA1 的血清样品，先在血凝板上A1～A5 孔中入PBST 稀释液50μL，然后在第A1 孔加入血清样品50μL， 混匀后吸出50μL 移到第A2 孔，依次稀释到第A5 孔， 从第A5 孔中吸出50μL 移到抗原抗体反应板（例如放在A1 孔）。把所有样品稀释完后移到抗原抗体反应板，对样品所在的位置做好标记。 用10～100μL 8 道移液器来稀释血清，这样效率更高。

3.2 阳性对照稀释 在抗原抗体反应板A11～H11 孔先加入PBST 稀释液50μL/孔， 然后在A11 孔中加入阳性对照50μL，混匀后吸出50μL 移到B11 孔，依次稀释到H11 孔，从H11 孔中吸出50μL 弃掉。

3.3 阴性对照稀释 在抗原抗体反应板A12～B12 孔 （例如）先加入PBST 稀释液50μL /孔， 然后在A12 孔中加入阴性对照50μL，混匀后吸出50μL 移到B12 孔，从B12 孔中吸出50μl 弃掉。

3.4 在样品孔、阳性对照孔、阴性对照孔中加入50μL/孔口蹄疫O 型病毒抗原（1×），在E12～H12 孔中只加口蹄疫O 型病毒抗原（1×）100 μL /孔，盖膜封板，振荡反应板10s 左右，然后放冰箱4℃静置过夜或放恒温箱37℃温育90min。

3.5 将抗原抗体混合液从抗原抗体反应板上按次序转移至已包被口蹄疫O 型兔抗的ELISA 板上，50μL /孔， 盖膜封板，放恒温箱37℃温育60min。

3.6 从恒温箱取板出来，甩掉板上的液体，每孔加入300μL PBST 稀释液洗板，连续洗板3～5 次，在吸水纸上甩干（可以把反应板倒置对着灯光看，孔里没有水珠就可以了）。 按50μL /孔加口蹄疫O 型豚鼠抗体工作液， 盖膜封板， 放恒温箱37℃温育30min。

3.7 从恒温箱取板出来，甩掉板上的液体，每孔加入300μL PBST 稀释液，连续洗板3～5 次，在吸水纸上甩干，按50μL /孔加兔抗豚鼠IgG-HRP 工作液， 盖膜封板， 放恒温箱37℃温育30min。

3.8 从恒温箱取板出来，甩掉板上的液体，每孔加入300μL PBST 稀释液，连续洗板3～5 次，在吸水纸上甩干，TMB 底物A 溶液和底物B 溶液以1∶1 比例混匀， 用移液器吸出TMB 底物A 溶液2.5mL 和底物B 溶液2.5mL 混匀（按实际用量计算，免得浪费试剂），加入混匀的底物溶液50μL /孔，37℃避光（可以在包被板上盖上报纸）显色15min。

3.9 从恒温箱取板出来，加入终止液50μL /孔，终止反应，打开酶标仪，在酶标仪上读取D450nm 值。

4 结果判定

4.1 实验认可标准：每板设4 孔病毒抗原对照，病毒抗原对照D450nm 值应在1.0 以上。阳性对照抗体效价应在1∶1024±1 滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1∶8。

4.2 血清抗体效价的判定：病毒抗原对照4 孔，弃去最高和最低D450nm 值，计算剩余2 孔的平均D450nm 值，再除以2，即50%对照值， 该值即为临界值， 表示阻断50%反应的对照D450nm 值。 被检血清D450nm 值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔。

5 小结与讨论

液相阻断ELISA 免疫抗体检测方法，具有灵敏性、特异性和稳定性，能及时、准确的监测抗体，为防控口蹄疫O 型疫病提供了有效保障。 80 份猪血清, 结果是阳性有78 份，阴性有2 份，抗体保护率为98%。 通过这个口蹄疫病毒O 型液相阻断ELISA 免疫抗体检测快捷方法，能快速、高效的提高工作效率。