牙源性间充质干细胞应用于牙周组织缺损修复的研究进展

施培磊 于晨浩 谢旭东 吴亚菲 王骏

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙周病科 成都610041

牙周炎是以牙周支持组织破坏为特征的慢性感染性疾病，临床上表现为牙周袋的形成、牙周附着丧失和牙槽骨的吸收等[1]。第四次全国口腔流行病学调查显示：我国成年人的牙周健康率仅为9.1%，牙周炎是导致我国成年人牙齿丧失的主要原因。传统的治疗方式是以洁刮治为主的牙周基础治疗，其目的是通过菌斑控制来消除牙周组织的炎症，促进牙周组织的愈合和修复。但是，对于牙周组织缺损较为严重的部位，仅使用传统的治疗方法促进牙周组织再生的效果有限[2]。引导组织再生技术（guided tissue regeneration，GTR）通过运用物理屏障阻止上皮向下迁移，为牙周膜细胞和成骨细胞的增殖提供空间，从而实现牙周膜、牙骨质和骨组织的再生。GTR的适应证相对局限，即使联合使用釉基质衍生物[3]和生长因子[4]等促进组织再生的药物，对于较严重的牙周组织缺损仍不能获得理想的牙周组织重建[5]。

间充质干细胞是一种发现于骨髓的成体干细胞，具有自我更新和多向分化能力，在组织工程、干细胞疗法等方面表现出较好的前景，多年来备受学者们的关注[6-8]。2000年，Gronthos等[9]从人第三磨牙牙髓中分离出牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC），此后，脱落乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）[10]、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）[11]、牙囊干细胞（dental follicle stem cell，DFSC）[12]、根尖乳头干细胞（stem cell from apical papilla，SCAP）[13]等牙源性间充质干细胞相继被分离出来。研究[14]发现：它们不仅拥有自我更新和多向分化能力，还能够调节免疫和炎症反应，加上相对易获取性，牙源性间充质干细胞被认为是理想的牙周组织再生的种子细胞之一。

1 牙源性间充质干细胞的特性

1.1 自我更新和多向分化

牙源性间充质干细胞的自我更新和多向分化能力，提示其具有分化并替代受损牙周组织的潜力。牙周膜是连接牙齿和牙槽骨的结缔组织，其中含有少量的PDLSC，在牙周组织受损时可修复牙周组织结构，重建牙周组织功能。PDLSC除了可以在体外诱导下分化成脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞外，还表现出比骨髓间充质干细胞强的自我更新和成骨细胞向分化能力，可以在小鼠体内形成牙骨质-牙周膜样组织[11]。位于牙髓中的DPSC源自于神经嵴，能够快速增殖，且能分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、成牙本质细胞，亦能被诱导分化为肌细胞或神经细胞。与骨髓间充质干细胞类似，其表面标志物包括Stro-1、CD29、CD73、D90、CD105和CD166，而CD14、CD45、CD34、CD25、CD28等造血相关标志物呈阴性[15]。

DFSC和SCAP因为分离自发育中的牙胚，在体内外都表现出更强的分化能力[16]。

1.2 旁分泌效应

近年来，学者发现间充质干细胞在没有分化并直接修复组织缺损的情况下，仍有一定的治疗效果[17]。值得注意的是，仅使用PDLSC的培养基也能促进牙周组织的再生[18]。研究[19]表明：间充质干细胞能够分泌丰富的生物活性分子，如生长因子、趋化因子等，通过旁分泌效应，来调节损伤部位的微环境，从而抑制细胞凋亡和炎症、促进血管新生，最终促进组织修复。研究[20]发现：牙源性间充质干细胞的免疫调节和抗炎作用能够帮助降低牙周炎患者牙周组织的活性氧自由基，从而缓解牙周炎症状。

2 牙源性间充质干细胞的使用方法

间充质干细胞在组织再生治疗中通常包含细胞的分离、体外扩增和细胞的再植3个步骤。随着研究的进展，干细胞治疗的难点逐渐从间充质干细胞的分离和鉴定转移到间充质干细胞的使用方法[21]。

目前，牙源性间充质干细胞的使用方法包括细胞悬液注射、细胞膜片、与生物支架联合使用等。

2.1 细胞悬液注射

细胞悬液注射是指直接将细胞注入受损的牙周组织，这种方法简单且创伤小[21]。Du等[22]将骨髓间充质干细胞注射在局部牙周缺损部位，在受损部位表现出炎症抑制和免疫调节作用，从而促进了新的牙周组织生成。然而，通过直接注射的方法，细胞往往难以定植和分化，而是通过旁分泌效应来促进组织自身修复，在受损组织部位无法获得稳定浓度的细胞或生物活性分子[23]。

近年来，学者尝试用温敏性的生物材料作为干细胞的载体，在一定温度下保持其流动性，以方便使用，同时能在体温下凝固，使注入的干细胞在移植位置保持稳定。Chien等[24]将诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-6用热敏水凝胶作载体，制成可注射的体系用于大鼠的牙周再生，获得了良好的效果。Pan等[25]将过表达血小板源性生长因子-BB（platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB）的PDLSC用温敏水凝胶作载体置入大鼠牙槽骨的缺损部位，表现出良好的促进牙槽骨修复的作用。

2.2 细胞膜片技术

细胞膜片技术是一种组织培养方法，因其培养过程不使用酶解，使细胞间连接、细胞外基质蛋白等组织结构得以保留[26]。Kwon等[27]使用温度反应性培养基成功将细胞连同其细胞外基质成片地剥离下来，并通过像三明治一样数层细胞堆叠起来，以构建出立体的组织。磁化控制法、电化学控制法等方法随后也被成功运用于细胞膜片的获取[28-29]。使用这种技术可以将间充质细胞在不使用支架的情况下移植入受损部位，相比传统支架，细胞膜片植入产生的炎症反应更轻，细胞丢失更少[30]。相较于细胞悬液注射，细胞膜片技术移植的细胞能够依靠细胞外基质贴附在移植部位，细胞间相互连接，能够存留更长的时间，有更高的细胞存活率[4,31-32]。同时，与细胞悬液相比，DFSC细胞膜片中的矿化相关基因（碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白等）和牙周组织特异性基因（Ⅲ型胶原蛋白、骨膜素）表达显著上调，PDLSC细胞膜片中也高表达碱性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白等基因[33]。

实际运用中单独使用细胞膜片往往不能完全填补组织空缺，在许多研究中常与羟磷灰石/磷酸三钙[34-35]、牛骨[36]、合成水凝胶[37]等支架材料合用，从而提高细胞膜片在根面的稳定性。Wang等[38]构建了在根面使用PDLSC细胞膜片，在牙槽骨面使用从颌骨分离的间充质干细胞膜片，中间填充以富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）的运用细胞膜片技术的双相生物膜片，在小鼠体内观察到2个面分别有牙周膜样组织和骨样组织的生成，是否有牙骨质的生成还有待进一步考证。

将PDLSC用于牙周组织再生的临床试验，采用的就是细胞膜片技术，Feng等[39]于2010年在一项临床试验中使用自体PDLSC细胞膜片治疗3名牙周炎患者，8周后患者牙周组织得到改善，细胞膜片周围可见类牙骨质和类牙周膜组织形成。另一项临床试验[40]中，同样使用自体PDLSC细胞膜片，10名患者6个月后探诊深度、临床附着水平、影像学骨高度都得到了明显改善，进一步证实了自体PDLSC细胞膜片长期治疗中的安全性和有效性。然而，也有临床研究[41]发现，使用自体PDLSC细胞膜片治疗与对照组（GTR）结果并无明显差异。

细胞膜片在植入受损部位后，高度依赖于宿主血管长入，如果血管网络不能及时的生成，堆叠的细胞缺乏有效的血供而因氧气和营养物质的不足以及代谢产物的积累，最终导致组织中央部位的坏死[42]。研究[43]发现人脐带血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）可初步引发PDLSC细胞膜片的血管新生。Panduwawala等[44]发现：不论是将HUVEC和PDLSC共培养后制成细胞膜片，还是制成PDLSC-HUVECPDLSC分开的3层，宿主血管长入的程度要优于PDLSC单独制成的细胞膜片。Zhang等[45]发现：HUVEC和PDLSC共培养能够使PDLSC血管内皮生长因子、成骨相关基因显著上调。研究发现：PDLSC与颌骨骨髓间充质干细胞共培养形成的细胞膜片相比于单细胞膜片，其成骨和细胞外基质生成相关基因高表达，体内实验产生了更接近天然组织的结构。

2.3 生物支架材料

支架材料可以通过改善干细胞移植效果、提高细胞移植部位的稳定性以及控制细胞的输送将间充质干细胞的疗效最大化[46-47]。除了降低移植细胞被冲刷掉的概率，使用材料作为载体还能够引入额外的生物活性分子，如血管内皮生长因子等，用来促进间充质干细胞在移植部位的生长和分化[48-49]。

随着组织工程的发展，牙周再生中的生物材料已经开始从简单的固定细胞和缓释活性分子的单相支架材料，逐步地开始模拟牙周的牙骨质-牙周膜-牙槽骨的复合结构。Iwata等[50]用3层PDLSC细胞膜片贴在牙齿根面后用可降解的聚乙醇酸网架支撑，最后多孔的β-磷酸钙填补骨缺损，6周后受损部位形成新的骨、牙骨质和穿插其中的胶原纤维，实现了牙周完整的恢复。

计算机辅助设计和3D打印技术的发展给间充质干细胞的运送提供了更多可能，能够制作出更加接近天然牙周组织的混合多相支架[51]，同时，3D打印技术能够针对各种牙周缺损定制个性化的支架材料。多相是指材料具有多种结构（孔径、孔隙形状、孔隙率等）或多种生化特性[52]。Lee等[53]使用聚己内酯和羟磷灰石（9∶1）通过3D打印技术制作出区域特异性的无缝三相支架，同时能够在材料的不同区域先后释放生物活性物质来诱导间充质干细胞分化。A相具有100μm的微通道，为牙骨质/牙本质界面；B相具有600μm的微通道，为牙周膜界面；C相具有300μm的微通道，为牙槽骨界面。A、B、C相分别能够在不同时间点释放釉原蛋白、结缔组织生长因子、BMP-2，在小鼠体内用DPSC做种子细胞，分化出牙本质/牙骨质-牙周膜-牙槽骨复合体。目前，已有利用3D打印技术制造的含生长因子的支架用于人牙周组织再生[54]。

3 展望

近年来，牙源性间充质干细胞的研究逐渐开始从动物实验进展到人体试验[39-40,55]。安全性是干细胞应用研究中无法绕开的话题。干细胞潜在的致瘤和促瘤风险备受关注，包括体外扩增过程中的基因改变、植入体内后形成肿瘤以及促进已有肿瘤的发展3个方面[56]。相对于胚胎干细胞和诱导多能干细胞，间充质干细胞致瘤风险较低[57]，但有报道[58]显示：在干细胞移植数年后出现了原干细胞来源的肿瘤，提示学者们对干细胞的安全性需要进行长期观察和评估。此外，移植后的免疫排斥反应也是干细胞应用中的问题。牙源性干细胞的免疫原性低，且自身有免疫调节能力，使同种异体干细胞移植成为可能。

牙源性间充质干细胞因具有与骨髓间充质干细胞类似的自我更新和分化能力，且更易获取的特点，成为牙周组织修复的研究热点。牙周组织复杂的软硬组织结构一直是牙周组织修复的难点。近年来，随着3D打印等技术的发展、细胞膜片技术的成熟、多相生物支架的运用，同时，对牙源性间充质干细胞生长分化过程的进一步了解，距离实现真正的牙周组织再生越来越近。与此同时，牙源性间充质干细胞的细胞外基质[59]、外泌体[60]、培养基[18]等非细胞成分也被证明具有促进牙周组织修复的作用，给研究者提供了实现牙周组织修复的另一种可能。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。