免疫组化SP法检测人乳腺癌组织中VEGF和VEGF-C的表达及意义

（营口市中心医院，辽宁 营口 115000）

乳腺疾病主要分布于患者乳腺腺体、脂肪、淋巴、乳头等部位，主要分为乳腺炎症、乳腺病变、乳腺肿瘤等。肿瘤细胞在发生扩散后，使乳腺其他器官发生病变，严重危害患者的生命安全[1]。乳腺肿瘤在生长过程中会摄取患者体内的营养成分和氧气，通过血管内皮生长因子为载体进行扩散[2]。本研究旨在研究免疫组化SP法检测人乳腺癌组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）的表达情况及检测意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年5月至2019年5月营口市中心医院收治的150例人乳腺癌患者作为乳腺癌组，对其进行病理检查和免疫组化SP法检测。所有患者均为女性；年龄34～58岁，平均年龄（43.25±6.21）岁；绝经患者63例，未绝经患者87例；根据乳腺癌组织病理学分类（2003）标准，上述患者的癌症分型为浸润型导管癌，其中98例患者出现癌细胞转移现象。另选取同期50例良性病变的乳腺纤维腺瘤患者作为良性乳腺纤维腺瘤组，对其进行免疫组化SP法检测，所有患者均为女性；年龄35～60岁，平均年龄（45.78±4.36）岁；绝经患者19例，未绝经患者31例。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。排除标准：不配合研究、精神异常者；患者心、肝、肾等器官严重异常者；在诊断前进行其他辅助治疗者。

1.2 方法

1.2.1 试剂 选取上海然泰生物科技代理的美国zymed公司生产的VEGF测定试剂盒（化学发光法）以及鼠抗人VEGF单克隆抗体和兔抗人VEGF-C多克隆抗体。设备为酶标仪和血液分析仪，酶标仪的型号为Stat Fax-210，血液分析仪的生产厂家和型号为Sysmex公司SF-3000自动血液分析仪。

1.2.2 方法 对乳腺癌患者和良性乳腺纤维腺瘤患者进行病理检查和免疫组化SP法检测。①取样：测量肿物病变大小、标记切缘、周围病变情况，若肿物有包膜，需观察并描述肿物与包膜的关系，并描述肿物性状，若肿物较小需采用多切面切开，若肿物距切缘较远，应取具有代表性的切缘进行取样，采用乳腺肿物切除法进行细胞活检，并制作标本将其保存备用。在VEGF检测过程中，血清应在术前采用真空保存，并加入促凝剂进行固定，同时采集患者晨起空腹状态下的静脉血3.5 mL，将其在室温下放置10～15 min后，选取转数为2 500 r/min的离心机进行离心处理，10 min后分离血清。将制备好的血清放入Eppendorf管中，在-20 ℃的环境下保存备用。②检验：对所有样本进行苏木素-伊红染色法（HE染色法）以及免疫组化染色。在进行免疫组化染色过程中，采用过氧化酶SP检测法，其中过氧化酶采用链霉素抗生物素蛋白作为药剂，在无菌环境下严格按照试剂盒的说明书进行操作，同时将石蜡进行切片并将其进行脱蜡操作，将霉素抗生物素蛋白3%过氧化氢进行水浴加热，有效清除该药剂中内源性过氧化物的酶活性，再利用抗原微波进行热修复，并用8%山羊血清对非特异的位点进行封闭，在操作完成后，将血清去除，在样本中分别依次滴加鼠抗人VEGF单克隆抗体和兔抗人VEGF-C多克隆抗体，在37 ℃下进行孵育，持续时间为12 h，并滴加酶生物素，采用HE染色对样本进行染色，最后封片。

1.3 观察指标 对免疫组化SP法检测人乳腺癌组织的结果进行判定。VEGF阳性界值为107.6 pg/mL（X+1.96 s）。其中，将不着色细胞定义为阴性，用-表示，阳性细胞数＜25%记为弱阳性，用+表示，阳性细胞介于25%～50%记为阳性，用++表示，阳性细胞＞50%记为强阳性，用+++表示。其中，VEGF与VEGF-C阳性表达为：患者肿瘤细胞、间质内皮细胞质、细胞膜出现清晰的黄棕色颗粒，选取其在40倍以下的低倍显微镜中观察阳性细胞最密集的区域，然后将该区域的细胞用100倍显微镜进行放大。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。计量资料采用（）表示，组间比较行t检验；计数资料采用[n（%）]表示，组间比较行χ2检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者VEGF与VEGF-C的表达情况比较 乳腺癌组中VEGF阳性率为67.33%（101/150），其中强阳性为20.00%（30/150）；阳性为41.33%（62/150），弱阳性为6.00%（9/150）；VEGF-C阳性率为59.33%（89/150），其中强阳性为17.33%（26/150）；阳性为30.67%（46/150），弱阳性为11.33%（17/150）。良性乳腺纤维腺瘤组中VEGF阳性率为16.00%（8/50），其中强阳性为2.00%（1/50）；阳性为8.00%（4/50），弱阳性为6.00%（3/50）；VEGF-C阳性率为4.00%（2/50），其中强阳性为0；阳性为2.00%（/50），弱阳性为2.00%（1/50）。乳腺癌组中VEGF阳性率高于良性乳腺纤维腺瘤组，差异有统计学意义（χ2=8.952，P=0.012）

2.2 两组患者VEGF与VEGF-C的表达特征比较 乳腺癌组和良性乳腺纤维腺瘤组中VEGF与VEGF-C强阳性表达呈棕褐色，位于癌细胞组织内，阳性表达呈黄褐色，位于细胞膜内，弱阳性表达呈黄色，位于细细胞质内。两组患者VEGF与VEGF-C的表达特征没有差异。

3 讨论

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，主要发生在乳腺腺上皮组织。乳腺癌细胞在生长过程中丧失了正常细胞的特性，容易脱落，游离的乳腺癌细胞会随着血液、淋巴液扩散，转移到全身，严重危及患者的生命安全。乳腺癌细胞主要通过人VEGF为载体进行扩散，VEGF是一种阳离子糖蛋白，能够有效促进血管表皮细胞进行增生、迁移，同时还会增加毛细血管的通透性，使血管内皮细胞受到刺激，为其提供良好的生长、存活以及增生环境和条件[3-5]。通过VEGF能够为肿瘤细胞提供生长必要的营养成分，为肿瘤细胞提供转移环境。VEGF包括VEGF-A、B、C、D、E以及胎盘生长因子[6-7]。

本研究结果显示，乳腺癌患者的血清VEGF、VEGF-C及阳性表达情况较良性肿瘤患者显著增高（P＜0.05），其原因主要是患者的肿瘤细胞分泌的VEGF通过血管壁进入血液循环中使其浓度增高。另外，乳腺癌患者与良性肿瘤患者的VEGF与VEGF-C强阳性、阳性、弱阳性表达出的性状无差异，以及VEGF与VEGF-C的生长位置无差异均位于癌细胞组织、细胞膜以及细细胞质内[8]。乳腺癌患者血清VEGF与VEGF-C与淋巴结转移、肿瘤临床分期具有密切联系，癌细胞阳性表达率与分期成正比。因此，采用免疫组化SP法检测人乳腺癌组织中VEGF和VEGF-C的表达在临床上具有重要意义[9-10]。

总之，乳腺癌患者的VEGF、VEGF-C的表达情况与乳腺癌的发生、转移具有直接关系，免疫组化SP法检测能够有效提高乳腺癌患者的VEGF、VEGF-C的阳性检出率。