非洲猪瘟自然弱毒株演变进程

戈胜强，王振忠，吕 艳，屈海龙，张潇月，胡永新，钱莺娟，吴晓东，王志亮

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.南京农业大学，教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室，江苏南京 210095；3.山东农业大学，山东泰安 271001）

自1921 年非洲猪瘟（African swine fever，ASF）在肯尼亚首次被报道以来，科学家就开始尝试对其病原特性及疫苗可行性进行研究。早期的研究发现，当ASF 在某一个地区定殖后，其烈性程度会降低，亚临床和慢性病例就会增多，而温和型的ASF 可能只有发热的临床症状[1]。这种现象可能是因为流行株已经适应猪与猪之间的连续传播或是最初感染的毒株就是弱毒株[2]。随着该病的不断蔓延和关注度的不断提高，ASF 分离毒株数量也在不断增加并出现多株自然弱毒株。虽然目前尚无疫苗研发成功，但是ASF 自然弱毒株的演变规律对于其科学防控具有重要的借鉴作用，而国内目前尚无专业介绍，没有全面展示ASF 自然弱毒株的演变进程，为此作者就ASF 自然弱毒株的现状进行综述，以期为我国ASF 的科学防控提供参考。

1 非洲、西欧和南美洲ASF 自然弱毒株演变过程（2007 年之前）

自ASF 在非洲被发现后，随着流行发病记录不断积累，科学家们逐步认识到该病主要是自限性流行（因为病死率接近100%）。但同时，该病也在非洲部分国家演变为地方流行性疫病，其主要表现是死亡率下降和出现大量慢性或隐性感染猪[2-4]。例如在1933 年，该病传播到南非西开普省时，共感染11 000 头家猪[5]，结果有8%的猪只存活。这可能是毒株与新地区宿主相互适应后毒力变化的首次报道[6]。相似地，1956 年报道安哥拉共和国（非洲西南部）养猪业（主要是散养模式）受ASF 影响损失惨重，但亚急性和慢性ASF 病例也逐渐增多。这也被认为是非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）在家猪体内反复传代的适应性变化[4，7-9]。1973 年，Pini[10]从南非分离出无红细胞吸附活性的低致病力毒株（Lillie-148 毒株，分离自南非德兰士瓦），1975 年又分离到无红细胞吸附活性的无临床症状毒株（24823，分离自南非彼得斯堡），这是非洲首次报道分离出该类毒株。这类毒株一直被认为是毒力减弱毒株。1979—1985年，Thomson分离到多株无红细胞吸附活性的毒株，其中扎伊尔毒株（Zaire strain）[11]接种12 头猪后，4 头死亡，8 头存活（2 头出现临床症状、6 头无临床反应），且其中存活的7 头猪攻强毒后均存活；姆库泽毒株（Mkuze）[3]接种3 头猪后，所有猪有体温反应和临床症状，表明其为中等毒力毒株[12]。基于上述发现及血清学诊断方法被推荐用于研究亚急性和慢性感染[13]，Haresnape 和Allaway[14-16]分别在1981—1986 年和1989—1991 年对马拉维（非洲东南部）开展ASF 流行病学调查并进行血清学监测，结果证实ASF 在马拉维部分地区已经成为地方流行性疫病，可能存在弱毒株流行。随后，莫桑比克（非洲东南部）[17-18]、塞内加尔（非洲西部）[13]、尼日利亚（西非东南部）[19-22]、乌干达（非洲东部）[23]、乍得（非洲中部）[24]、刚果（非洲中西部）[25-26]等非洲国家均监测到一定比例的ASF 血清学阳性猪或ASFV 感染康复猪。虽然对于ASF 已经成为地方流行性疫病的部分非洲国家，该病的死亡率已经降至50%～60%，危害性似乎降低很多，但当其新传入某地时仍导致大量农场感染，一半以上的猪群死亡，表明其仍可造成灾难性后果[27]。

当ASF 在一个国家流行较长时间后，其临床表现将由急性发病转变为缓慢发病或出现新的临床表现[8]。最典型的例子是，1960 年该病传入西班牙时，感染猪病死率可达100%，传入3～4 年后，开始出现亚临床或潜伏感染猪[8]。伴随着该病的持续流行，感染猪死亡率逐渐下降，至80 年代时降到了2%～3%，甚至一些病例中出现无临床症状感染猪[8]。而且发病猪体内的病毒载量大幅下降（组织中载量由106.5HAD50/g 降为102.5～104.5HAD50/g），典型病变发生改变（脾脏病变转变为胃肝淋巴结和肾淋巴结病变为主），红细胞吸附活性毒株分离率降低（分离株首次传代红细胞吸附活性比例由90%～95%降为80%～85%）[28]。葡萄牙的ASF流行情况也比较相似，流行初期时（1957—1960年）ASF 致死率可达100%，但1980 年以后出现了大量的亚急性病例（特别在葡萄牙南部的阿伦特霍省）。同时，也发现一些有ASF 抗体但无任何临床症状的潜伏感染猪[29]。这些临床症状的变化可能与西班牙和葡萄牙大范围使用的疫苗株（以1960 年分离的Lisbon 60 毒株为母本毒株，在猪骨髓细胞上连续传代所得[30]）扩散有关[4，8，31-32]。1968 年，葡萄牙从一只慢性感染猪体内分离到一株无红细胞吸附活性的自然弱毒株，命名为NHV（NH/P68）[33-34]，此时距葡萄牙首次疫情已过去8年。该毒株毒力已显著下降且无红细胞吸附活性，后经全基因序列分析推测，此毒株可能是Lisbon 60 疫苗株演变而来[35]。1974 年，Vigário 等[36]报道从葡萄牙慢性肺炎猪体内分离到无红细胞吸附活性的毒株（ASFV-NHA）。1988 年，葡萄牙又从栖居于猪场的游走钝缘蜱（O.erraticus）中分离到无红细胞吸附活性的弱毒株，命名为OURT88/3、OUR T88/4 和OUR T88/5 等。同时期，从软蜱体内也分离到有红细胞吸附活性的强毒株（如OUR T88/1，OUR T91/1 和MAR T92/1 等）。无红细胞吸附活性的弱毒株和部分有红细胞吸附活性的强毒株分离自同一个农场，这可能暗示临床中弱毒株提供的“免疫”保护使得强毒株存活下来，这也部分解释了葡萄牙南部的阿伦特霍省为何存在无临床症状的血清阳性猪群[29]。

西班牙和葡萄牙低死亡率ASF 疫情的流行，导致了伊比利亚半岛出栏的生猪携带更多ASFV，由此生产加工出的猪肉制品通过销售渠道将ASF传播到法国（1964年、1968年和1974年）、古巴（1971年和1980 年）、马耳他（1978 年）、意大利撒丁岛（1978 年）、巴西（1978 年）、多米尼加（1978年）、海地（1978 年）、意大利（1967 年和1968年）、比利时（1985 年）和荷兰（1986 年）[9]等。虽然继西班牙和葡萄牙之后，相继发病的国家中有的首发疫情很难追溯到源头，但巧合的是，后期流行的毒株有一大部分是低毒力的。例如，法国1974 年传入的毒株可能为毒力减弱毒株[4]，而且在马耳他[37-38]、海地[39]、巴西和多米尼亚[40-41]都出现过低死亡率的ASF 疫情或监测到ASF抗体阳性猪[42]，部分地区还分离到中等毒力毒株[43]，如巴西1978 年分离株（Brazil'78）[40-44]，马耳他1978 年分离株（Malta'78）[37]和荷兰1986 年分离株（Netherlands'86）[45-46]等。该病的进化趋势使低毒力毒株得以流行，导致控制该病流行过程中面对的问题更加复杂[8]。

2 东欧、中欧ASF 自然弱毒株演变过程（2007年之后）

截至2007 年，欧洲绝大多数国家已成功根除ASF（除意大利撒丁岛），并通过有效的防控措施阻止了该病传入，因此20 世纪末欧盟被认定为ASF 无疫区。但2007 年该病再次进入欧亚大陆后（格鲁吉亚首发），疫情发展速度远超以往。俄罗斯（2007年）、乌克兰（2012年）、白俄罗斯（2013年）、立陶宛（2014 年）、爱沙尼亚（2014 年）、波兰（2014年）、拉脱维亚（2014 年）、罗马尼亚（2017 年）、捷克（2017年）、匈牙利（2018年）、比利时（2018年）和德国（2020 年）等国家相继暴发ASF。虽然大多数分离毒株的序列分析显示，俄罗斯及欧洲其他国家流行的ASFV 与格鲁吉亚2007 毒株（Georgia 2007/1）高度同源，病死率接近100%。但是部分研究显示，从野猪体内分离的毒株毒力更低，感染后病程更长[47]，同居攻毒试验中有无症状猪存活（1/10）[48]，甚至口鼻攻毒后出现不发病现象（1/10）[49]。同时，一些监测数据[49-51]显示，某些特定区域中存在无症状但ASF抗体阳性的野猪，这说明尽管最初传入的是强毒株，但一些感染猪在某些时候可以存活，保持亚临床感染甚至康复，这可能是由于流行毒株毒力减弱，使得一部分动物初次感染后获得免疫力而存活下来甚至康复[52]。为查明俄罗斯ASF流行株中是否存在毒力减弱毒株，Pershin[53]对俄罗斯境内分离的ASFV（2013—2018年）进行动物接种试验，结果Lipetsk 12/16 毒株（分离自利佩茨克，俄罗斯西南部城市）和Odintsovo 02/14毒株（分离自莫斯科州，俄罗斯欧洲部分中部）的病死率分别为50.0%和87.5%，且Lipetsk 12/16毒株接种存活猪攻强毒后（使用Orlovsky 03/17 毒株）全部存活。

欧洲的研究中也发现了相似的毒力减弱毒株。2018 年，Nurmoja 等[49]在对野猪攻毒试验中存活猪样品分离到的病毒进行全基因组测序，发现了一株大范围基因缺失株（与Georgia 2007/1 基因组相比，ASFV-Estonia 株在5'端缺失14 560 bp）。进一步对不同地区的野猪临床样品检测，Zani 等[54]证实爱沙尼亚Ida-Viru 郡（东北方向）存在这种毒力减弱毒株[54]。2017 年，Gallardo 等[55]在拉脱维亚野猪体内分离到无红细胞吸附活性的自然弱毒株（Lv17/WB/Rie1）并经攻毒保护试验证实其安全有效。随后，基于该毒株的野猪口服疫苗研究开启[56]。目前该口服疫苗仍在评价中。

3 国内ASF 流行演变推测及防控对策

自2018 年ASF 传入我国以来，疫情报告次数呈现大幅下降趋势（2018 年99 起、2019 年63 起、2020 年19 起）。但2021 年的科技文献[57-58]显示，该病在国内的流行情况出现新的变化，主要是出现死亡率下降、临床症状不典型、分离到无红细胞吸附活性的“自然变异株”。临床中出现“自然变异株”，特别是无红细胞吸附活性的毒株符合ASF 自然发展规律，如论文中报道的ASFV 自然变异株HuB-20[57]和HLJ/HRB1/20[58]均在CD2v 功能区发生基因丢失，导致该毒株无红细胞吸附活性。鉴于该类毒株的出现，未来ASF 流行可能将呈现更加复杂的变化，“非典型ASF”的案例可能会逐渐增多并进一步在部分区域流行散发。

“自然变异株”因毒力减弱可能存在临床症状不典型，容易与其他疫病混淆的特点。这意味着单纯的病原学检测方法（如荧光定量方法）存在漏检可能性。同时，国外成功根除ASF 的国家在最后阶段都使用血清学方法进行筛查，而目前国内尚无批准应用的血清学诊断产品，因此建议应加强这方面的研究、加快产业化报批进程，并在适宜情况下适时开展血清学监测追溯。此外，应进一步加强监督管理，严厉打击非法生产、使用ASF 疫苗的行为，消除其对ASF 疫情防控的不利影响；加大ASF 临床流行病学、分子流行病学和血清流行病学监测力度，及时了解流行动态，以便制定更加有针对性的防控措施。