动物疫病PCR检测实验室的污染原因分析

杨柏 赵伟铎 张静

（1.烟台海关技术中心 山东烟台 264000；2.烟台海关）

1 前言

PCR检测技术能使微量DNA发生大幅增加，在动物疫病检测环节应用该技术，能无限放大动物DNA片段，为动物疫病防治工作提供有利依据。但是运用PCR技术检测动物疫病时，一旦实验室受到污染，就会对检测结果的准确性产生影响。因此，有必要详细梳理动物疫病PCR检测实验室的污染源，针对性地采取有效对策加以防控，不断改善实验室环境，提高检测质量。

2 动物疫病PCR检测实验室的污染原因

2.1 试剂污染

PCR试剂受到污染是造成PCR污染的关键原因之一，因为试剂在实验操作中属于基础性实验耗材，科学规范地存储和使用试剂，能够有效减少试剂在实验操作中所接触的污染物。如果在配置PCR试剂过程中，出现操作不当情况，就可能使加样枪、双蒸水、容器或其它相关溶液受到PCR核酸模板的污染。

2.2 PCR扩增产物受污染

PCR扩增产物受污染也是造成PCR污染的一项常见的、重要的污染问题。由于PCR产物具有极高的拷贝量，并且相应量远高出PCR检测的多个拷贝极限，即便受污染的PCR产物是极其微量的，都可能成为实验室的污染源，并在较大程度上破坏实验室环境，从而出现假阳性，影响实验结果的准确性[1]。

2.3 样本交叉污染

样本间出现交叉污染也是引发PCR污染的关键因素，如果在储存实验标本过程中，不能做到密封严密或选用错误的密封方法，就会造成样本间发生交叉感染。另一种客观原因是储存实验标本的容器受到污染，如样本容器外部附着标本引发交叉感染，或人为提取样本核酸模板时操作不当使移液枪受到污染等[2]。样本交叉污染的情况在实验操作过程中比较常见，必须规范操作，注意细节，避免样本发生交叉污染问题，保证实验结果的准确性。

2.4 操作人员的污染

在实验过程中，操作人员盲目追求检测效率，出现操作失误的情况，或因操作人员防护不当，其皮肤、头发等所附着的细菌沾染试剂，也有可能会造成PCR污染。为避免这些问题，操作人员需要高度重视实验规范化，注意操作细节要求及操作安全知识，充分做好防护措施，减少人员污染。

3 污染防控对策

3.1 预防污染措施

3.1.1 PCR实验室加强分区管理

为有效防止动物疫病PCR检测实验室受到污染，一个重要措施就是要在PCR实验室中加强分区管理，从根源上杜绝实验室污染，全面提升污染防治效果。在实际管理过程中，可把实验室划分为3个区域：标本处理区，在该区域内主要制备扩增模板；PCR扩增区，在该区域内主要进行反应液配置及PCR扩增；产物分析区，在该区域内主要进行凝胶电泳分析，并对产物进行拍照，同步制备重组克隆。在实验室设计中，需要采取有效措施将这些工作区完全分隔，并且在操作期间选用专业器械，尽可能防止发生交叉感染[3]。

3.1.2 保持良好的操作习惯

实验室中因操作不当导致样本交叉污染，进而影响实验结果准确性的事件时有发生，因此，实验室操作人员应当养成良好的操作习惯。实验前和实验后都要通过紫外线消毒方式对实验区域进行消毒；实验过程中操作人员需要按照要求使用一次性手套、帽子、口罩，根据不同分区使用专区专用的工作服，并注意勤换手套；在操作时要注意选择一次性吸头，相关吸头要注意和PCR产物分析区所使用吸头严格分开，禁止混用，并且不能长时间的将吸头暴露在空气当中，以防气溶胶受到污染；操作人员在打开反应管时动作要轻缓，以防发生反应液飞溅情况，在开盖之前略微离心，保证液体全部收集在管底，一旦不小心溅到桌面或手套上，需立即更换手套，并使用稀酸对桌面进行擦拭；在对多份样本反应液进行制备时，要注意混合好dNTP、引物、缓冲液、酶，并做好分装工作，减少重复操作，在规避污染的同时，还能提升检测效率。

3.1.3 做好试剂分装和储存工作

在操作过程中，最好事先配置PCR反应液，之后进行小量分装，在-20℃的环境中保存，减少重复加样次数，进而降低污染发生率。同时，要注意PCR试剂和反应液，应当与PCR产物及样品分开保存，避免存放在同一冰箱内或同一冰盒中。

3.1.4 优化实验设计并降低PCR循环频次

实验设计要不断优化，尽量缩减PCR循环频次，能够保证PCR产物符合检测标准及水平即可，以有效规避大量高浓度扩增产物引发的污染问题。若已经发生了污染，需要立即通过正确方法追踪污染物，明确污染源，做好污染处理工作，确保实验可以顺利、有序的推进。

3.2 污染源处理措施

3.2.1 通过酶法与化学法降解DNA

一旦动物疫病PCR检测实验室出现污染问题，可通过2 mol/L的HCL或10%次氯酸钠对污染源进行浸泡及擦洗，使得所残留的DNA分子受到破坏，将污染源全面消除。相对而言，10%次氯酸钠对污染源的破坏力更强。如果杂质DNA片段含有酶切位点，为有效消除污染源，可通过限制性内切酶加以处理，但是此方法在应用中限制性内切酶需要使用高盐溶液，对PCR反应会产生一定影响。

3.2.2 运用尿嘧啶DNA糖基化酶法

在PCR反应中，将dTTP替换为dUTP，可使PCR产物中含有dU修饰，相应DNA片段经修饰后能够被糖激化酶消化，去除其中的dU[4]。而DNA片段在失去dU之后，就无法被当做PCR反应模板。在实现PCR反应之前，把糖基化酶添加到未加Taq酶之前的PCR反应混合液中，能够消化之前残留PCR产物中的dU，若模板DNA不包含dU，则不会受到影响，之后再添加Taq酶实现PCR反应，在PCR反应变性步骤影响下，UNG就会失活，而新合成的包含有dU的PCR产物不会受到影响。

3.2.3 运用紫外照射法

通过紫外照射能促使DNA中产生嘧啶二聚体，造成特定损伤，如DNA链断裂，进而使DNA结构受到破坏，使其无法在实验中当做PCR反应模板。因此，在实验室内可以采用紫外照射法，对PCR污染源进行消除处理。

如果通过上述方法仍不能有效消除污染，那么实验室需要考虑设计新引物，所设计的新引物需要和原引物不具备相关性，以此规避受原模板污染的影响，使对应的扩增产物也能够避免受到污染，从根源上消除实验受到污染的不良影响。

4 结论

动物疫病PCR检测实验室应当高度关注污染防治工作，加强实验操作的严格与规范。造成PCR污染的主要因素是PCR试剂污染、PCR扩增产物污染、样本交叉污染、操作者污染等，在实验操作期间每位操作者都应当保持严谨科学的工作态度，认真对待PCR检测实验，有效规避实验中因个人操作不当引发的污染。在PCR技术持续发展及不断扩大应用领域的过程中，应当不断完善PCR污染的防控措施，使PCR技术能够更安全有效地应用于动物疫病检疫及诊断。