耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分型方法研究进展

武 杰，赵建平

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是革兰阳性球菌，在一般人群中的携带率为25%～50%，但在某些情况下也可成为致病菌，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）已经成为了医院和社区获得性感染重要病原之一[1]。由于抗生素的广泛使用，MRSA不仅对β内酰胺类耐药，对其他临床常用抗生素敏感率也逐渐降低。在欧洲，金葡菌中MRSA的检出率约为29.9%[2]。在中国，根据2019 年CHINET 三级医院细菌耐药监测数据，临床分离的革兰阳性菌中最多的是金葡菌，而在金葡菌中MRSA的检出率为31.4%，并且相比于甲氧西林敏感菌株，MRSA对大环内酯类、氨基糖苷类和喹诺酮类等抗菌药物的耐药率均较高[3]。

为此，近年一些临床实验室开展多种MRSA的分型研究以了解MRSA分布、耐药性和系统发育情况，为进一步预防和控制MRSA感染提供理论依据。MRSA的分型方法多种多样，传统的有噬菌体分型，而新兴的分型方法大多基于基因的多态性运用分子生物学的方法，常用的分型方法有噬菌体开放阅读框分型法（phage open-reading frame typing，POT）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型、葡萄球菌染色体盒（SCC）mec（staphylococcal cassette chromosomemec，SCCmec）分型、辅助基因调节因子（accessory gene regulator，agr）分型、多位点序列分型（MLST）、葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A，spa）分型、DNA微阵列分型[4-5]等。本文对国内外一些主要的MRSA分型方法进行综述，旨在为MRSA感染的分析和流行病学调查方法提供思路。

1 噬菌体分型

由于不同细菌感染不同噬菌体的能力不同，当金葡菌受到一系列噬菌体的攻击时，根据攻击的结果，即细菌是否被噬菌体群杀死，可以确定细菌的噬菌体类型。国际公认的23个噬菌体（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和其他噬菌体）的基本组合可用于金葡菌的噬菌体分型。通常将23种噬菌体（RTD浓度）分别滴一滴于已培养好的涂布了MRSA的分型琼脂平板上，过夜培养后观察结果，根据溶菌结果判定分型情况。在最初进行MRSA的流行病学研究时，噬菌体分型在分析已知流行菌株中有一定价值; 但是其分型结果重复性差、结果分析存在主观性以及较多MRSA菌株不能分型[6-7]，现在国内有关MRSA分型的报道中已较少使用该方法。

2 POT

为了克服噬菌体分型不便于实验室间比较等缺点，2006年Suzuki等[8]报道了一种基于PCR的快速MRSA菌株分型新方法，即POT，其扩增片段为MRSA中噬菌体基因组的开放阅读框。Kawamura等[9]分别使用POT和PFGE对分离自医院内的44株MRSA进行分型，表明两种分型方法结果一致，均有效地鉴别出了12次MRSA感染暴发中的11次，鉴定成功率为91.7%,可见POT法是调查医院MRSA感染暴发的一种有效的流行病学工具。但是近年使用POT对MRSA分型的报道仍然很少，可能与该方法的不稳定性和重复性差有关。

3 PFGE分型

PFGE是一种有效的基因分型方法，于1984年Schwarz和Cantor首次提出，由于其分型率高、分辨率高、重复性好等优点曾被认为是MRSA分型的“金标准”[10]。在一项关于MRSA引起的非医院环境感染的荟萃分析中，通过PFGE的分型表明MRSA菌株来自医院和社区，且非医院环境中MRSA感染的比例总体上很高[11]。PFGE分型在MRSA相关性分析、感染源追踪和感染控制等方面作用明显。对患者、医护人员和病房环境中分离细菌的PFGE带型进行分析，有助于院感部门确定感染源和传播途径，采取有效措施根除传染源，阻止传播，极大降低发病率和死亡率[12-13]。在一项分析来自中国东南地区某三级医院不同病区和科室医护人员的常规拭子以及MRSA分离菌的PFGE分型结果的报道中，由于从外科病房分离的2株MRSA具有相同的PFGE模式，表明MRSA可能在外科医护人员之间传播，提示医院应有效控制可能存在的交叉感染[14]。

然而，这项技术操作耗时长、技术要求高、试剂成本大、需要专业的设备，对于差异很小的某些菌株难以区分，且PFGE带型可表示菌株克隆关系的远近而不表示真正的系统发育过程。此外，凝胶制备和电泳条件（如温度、湿度、设备等）的细微改变也会影响最终的分型结果，使得不同实验室间的结果比较存在差异。

4 SCCmec分型

遗传元件SCCmec是MRSA的耐药决定基因所在位点。SCCmec主要由mec基因复合物、ccr基因复合物和J区（连接区，分为J1、J2、J3）构成。mec基因复合物以mec基因为主，共有A、B、C、D、E 5种mec基因复合物类型，其中最重要的是mecA基因，可编码对大多数β内酰胺类抗菌药物结合力较低的一种新的青霉素结合蛋白（PBP）2a，从而对此类药物耐药。ccr基因复合物中起主要作用的是盒式染色体重组酶（ccr）基因，ccr基因被分为ccrA、ccrB、ccrC三种类型[15]，可以对葡萄球菌染色体上的SCCmec切除和/或整合。根据mec基因复合物、ccr基因复合物和J区的各自不同类型，可将SCCmec分为各种类型（包括亚类），过去国际公认的有Ⅰ型～ⅩⅢ型，而最近又新发现了SCCmecⅩⅣ型[16-17]。研究表明，中国MRSA分离株中，SCCmecⅢ型最多，其次为Ⅳa型、Ⅱ型、Ⅰ型等[18]。由于SCCmecⅠ～Ⅲ型主要见于医院获得性MRSA(HA-MRSA)，而SCCmecⅣ、Ⅴ型主要为社区获得性MRSA(CA-MRSA)，此方法可能对鉴别医院和社区感染，了解当前出现的MRSA暴发的流行病学起到重要作用。

在方法学上，SCCmec分型主要通过多重PCR，即同一反应体系中加入多对针对不同SCCmec型所设计的引物，最终对目的DNA进行扩增。2002年Oliveira等[19]使用多重PCR法初步快速鉴定MRSA菌株SCCmecⅠ～Ⅳ型。2005年Zhang等[20]开发了一种新的多重PCR方法，可分析MRSA菌株中SCCmecⅠ～Ⅴ型及Ⅳ型的4种亚型Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd，他们提出并验证了新的8对引物对SCCmec（包括亚型）分类的可行性和实用性。2007年Boye等[21]设计4对引物就可将MRSA菌株分为SCCmecⅠ～Ⅴ型的方法，此方法简便、节约成本，但未能对亚型分类。鉴于先前的研究，2013年Mcclure-Warnier等[22]设计并发现了一种简单的多重PCR方法，用于快速筛选主要的SCCmec类型，主要为Ⅰ～Ⅴ型及Ⅵ型和Ⅷ型，其中Ⅳ型最多可分为A～F亚型。遗憾的是，目前的多重PCR法主要用于SCCmecⅠ～Ⅴ型分析，不仅需要开发新的PCR对Ⅵ～ⅩⅢ型分型，更需要一种方法能将所有SCCmec类型及亚型进行准确分析。不仅如此，不断新发现的SCCmec类型将对多重PCR法要求更高。

5 agr分型

agr是金葡菌的重要调控成分，参与调控不同独立基因的表达和控制多种毒力因子的产生。agr是基因组中的一个多态性位点，agr高变区包括agrB基因C末端的三分之二、整个agrD基因以及agrC基因N末端的一半。agr可分别通过P2、P3启动子转录RNAⅡ和RNA Ⅲ。RNAⅡ促进agrB、agrC、agrD、agrA基因表达，其产物膜蛋白AgrB将AgrD即前体自动诱导肽（AIP）转化为成熟的AIP并分泌到胞外，当AIP浓度到达临界阈值时，AIP与膜结合受体组氨酸激酶AgrC结合并使AgrA磷酸化，活化后的AgrA又可促进RNAⅡ和RNAⅢ的转录[23]。由于不同MRSA菌株agr具有多态性，其编码产生的AIP及相应受体氨基酸序列也具有多态性，所以金葡菌分为4个agr型（Ⅰ～Ⅳ型）[23-24]。RNA Ⅲ可上调多种毒力因子如溶血素、肠毒素等的表达和下调细胞表面蛋白如纤维连接蛋白等的表达,以抵抗宿主防御和促进组织侵袭[24]。Francois等[25]报道了一种多重实时定量PCR可快速地确认agr类型，并且由于试剂成本较低，也适用于临床实验室和流行病学检测。Abimannan等[26]对印度南部分离自医院和社区的MRSA菌株进行分型，发现主要的agr类型为agrⅡ型，其次是agrⅠ、agrⅢ和agrⅣ型。但agr分型具有地区差异性，Goudarzi等[27]对伊朗德黑兰地区106株MRSA进行分型发现agrⅠ型菌株是最多的，其次为agrⅡ、agrⅢ，而未发现agrⅣ，这与国内贾珉等[28]的研究结果一致。有研究表明大部分MRSA菌株的agr类型与特定的临床感染有关。例如，大多数引起经期中毒性休克综合征的MRSA菌株属于agrⅢ型；引起葡萄球菌烫伤样皮肤综合征（SSSS）、大疱性脓疱病的MRSA多为agrⅣ型[29]。大多数万古霉素耐药的MRSA菌株属于agrⅡ型[30]，而从患有心内膜炎的患者身上分离到的MRSA菌株主要与agrⅠ型相关[31]。agr分型具有可靠性高、重复性好、特异性强等特点，MRSA菌株的agr分型有助于了解其遗传背景特征及致病性的特点，进而对预防MRSA感染和临床用药提供指导，并广泛应用于MRSA的流行病学调查和监测。但是agr分型更适用于携带毒力基因的菌株，并且不同地区agr分型结果难以统一，因此需要参考其他分型方法综合分析。

6 MLST

MLST是在多位点酶电泳(multilocus enzyme eiectrophoresis，MLEE)分型技术的基础上发展而来，MLEE是从细菌中提取出蛋白质进行凝胶电泳，根据蛋白质条带之间的相似程度对细菌分型，而MLST对MRSA菌株的7个管家基因扩增测序，极大地改善了MLEE分型的精确性[32]。这7个管家基因分别是arcC（编码氨基甲酸激酶，456 bp）、aroE（编码莽草酸脱氢酶，456 bp）、glpF（编码甘油激酶，465 bp）、gmk（编码鸟苷酸激酶，429 bp）、pta（编码磷酸乙酰转移酶，474 bp）、tpi（编码磷酸三酯异构酶，402 bp）和yqiL（编码乙酰辅酶A，516 bp）。由于等位基因的多样性，不同来源的MRSA菌株其管家基因有着不同的核酸序列，对7种管家基因扩增测序，并将结果提交到MLST数据库（http://www.mlst.net）对比分析，最后得到菌株MLST结果，并赋予每个菌株数字形式的序列类型（ST）。对我国海南省分离自临床的金葡菌的分子特征分析显示，ST398、ST188和ST45是金葡菌分离株中的主要类型，其中ST398和ST45分别是甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）和MRSA分离株中的主要克隆[33]。然而，对意大利南部一家养殖场的猪和工作人员MRSA分离株进行MLST测定，结果显示ST398是家畜相关MRSA（livestock associated MRSA，LA-MRSA）其主要类型[34]。可见，MRSA菌株的ST流行类型的多样性与地区、宿主有关，并且HA-MRSA、CA-MRSA和LA-MRSA中的优势ST型有较大差异，提示MRSA感染的来源和潜在的传播路径。

MLST分型精确性好、可重复性强。对于新发现的ST型，上传到MLST网站后其结果也便于不同实验室间进行比较确认，使这项技术成为一个全球非常有用的流行病学分析工具。但是这种方法与MRSA的毒力基因没有任何关系，MRSA的致病性不能被清楚认知。MLST的另一缺点是成本高且操作复杂。

7 spa分型

spa基因具有多态性，编码特异性蛋白A，在金葡菌中高度保守，并提供合适的短重复序列区域作为单基因座序列分型的靶点，即spa分型。这是一种基于DNA序列的分型方法，专门用于金葡菌的鉴定，spa基因经PCR扩增后进行序列测定，即可获得分型。spa基因长度约为2 150 bp，包含三个区域：Fc结合区、X区和C末端区域。X区域，也称为重复区域，由数目不定的长度为21～27 bp（主要为24 bp）的重复序列组成。由于重复序列的数量、排列顺序和缺失、插入等改变，该区域具有多态性[35]，进而反映spa的多种类型。

截止现在，Ridomspa服务器数据库（http：//www.spaserver.ridom.de）包含19 392种spa类型、802个重复序列和431 456个菌株，其数据来自全球143个国家及地区，可以对测得的spa分型结果进行对比分析，并收录新发现的spa类型。除了使用PCR方法外还可使用高分辨率熔解（highresolution melt，HRM）曲线分析spa基因分型，该方法也需要对spa基因扩增，然后升温解链，根据与标准曲线对比进行分析，是一种可靠、经济且简便的分型方法，可以用作流行病学研究[35-36]。

spa分型稳定性高、重复性好。Malachowa等[37]用59株医源性金葡菌对PFGE、MLST、多位点可变数目串联重复分析（MLVA）和spa分型四种分型方法进行了水平比较，结果表明spa分型更接近MLST，并且建议将多种分型方法结合起来可进一步研究MRSA菌株分型结果。

与其他方法相比，spa分型具有成本效益高、操作方便、快速、重现性好等优点。此外，spa分型稳定，有一个标准化的国际命名法，可以整合到国际数据库，使用spa分型有助于了解医院和社区环境中MRSA的克隆多样性及其传播[38]。但是，spa分型只局限于spa基因X区域的突变，对于MRSA基因组其他部分的改变未能有效判别，甚至出现错误分型。研究表明[39]，t008和t002是全球分布最广的spa类型，t032是欧洲最普遍的spa类型，主要集中在英国和德国且该类型菌株大多是MRSA，t008是美国最流行的类型，而t030是我国的主要类型。

8 DNA微阵列分型

DNA微阵列，也称DNA芯片或基因芯片，是一种利用有序的附着在固体表面的DNA探针对样品DNA进行识别测定的新技术。探针可以是寡核苷酸或基因片段，当其与样本DNA（通常用荧光素标记）杂交时，产生的信号被采集并通过检测器分析，以检测特定细菌物种中是否存在互补核苷酸序列。据报道，DNA微阵列可以共价固定大约与180多个金葡菌基因相关的300个特异性探针，这些基因可以是分型位点、毒素基因、微生物表面成分相关基因以及药物抗性基因，因此通过基因芯片技术，对病原菌进行基因分型的同时，也可研究其毒力和耐药性，扩大了MRSA研究范围，为临床防治MRSA感染提供更全面的指导意见[40-42]。虽然DNA微阵列分型准确度高、分析范围广，但是需要昂贵的仪器和繁琐的操作步骤，并且无法检测到微阵列中未包含的基因。该实验耗时较长，需要将从细菌中提取的DNA扩增后才可用于杂交。

9 总结与展望

MRSA在世界各地蔓延，分型方法对于医院感染控制和流行病学研究至关重要。目前，传统的分型方法几乎已被淘汰。除DNA微阵列分型（此方法应用较少）外，PFGE分型、SCCmec分型、agr分型、MLST和spa分型等是主流方法，但由于每种方法优劣不同，现在多综合运用多种方法，详细分析各地区MRSA的流行类型和分子特征。除此之外，在PCR方法中还有扩增片段长度多态性（AFLP）分型，随机扩增多态性DNA（RAPD）分型以及极具潜力的更为精细的全基因组测序方法。在未来，MRSA分型方法将不断创新，向分辨率更高、可重复性更强、分析速度更快、操作更简便、信息化和自动化更完善的方向发展，能广泛地应用于临床实验室，为预防和治疗MRSA感染以及流行病学调查和追踪提供全面、准确、及时的信息。