BATF2真核表达载体的构建及其对肝癌细胞Bel-7402增殖的影响

张畅　周浮杨　郑宇航　魏超越　王璎珞　孙艳

【摘要】 目的：构建人BATF2真核表达载体，并验证其过表达对肝癌Bel-7402细胞增殖的影响。方法：利用Trizol法提取正常人外周血单核细胞RNA并将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板扩增出BATF2基因序列，再将其连接到pcDNA3.1真核表达载体上，采用酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定;用脂质体转染的方法将重组质粒转染Bel-7402细胞后，Western blot检测BATF2蛋白表達变化，MTT法检测对细胞增殖的影响。结果：双酶切和DNA测序结果验证了pcDNA3.1-BATF2真核表达载体构建成功;pc-DNA3.1-BATF2组BATF2蛋白表达量高于空白对照组与pcDNA3.1组（P<0.05）。转染48、72、96 h后，pc-DNA3.1-BATF2组Bel-7402细胞增殖的OD值均低于空白对照组和pcDNA3.1组（P<0.05）。结论：成功构建pcDNA3.1-BATF2真核表达载体并转染Bel-7402细胞后BATF2蛋白表达量增加，且过表达BATF2能够显著抑制肝癌细胞Bel-7402细胞增殖能力。

【关键词】 BATF2 真核表达载体 Bel-7402细胞 细胞增殖

[Abstract] Objective： To construct the eukaryotic expression vector of human BATF2 and verify the effect of its overexpression on the proliferation of hepatoma Bel-7402 cells. Method： The RNA of normal human peripheral blood mononuclear cells was extracted by Trizol method and reverse transcribed into cDNA. The BATF2 gene was amplified by the cDNA template， and then linked to pcDNA3.1 eukaryotic expression vector. The recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid was transfected into Bel-7402 cells by the method of liposome transfection. After the recombinant plasmid was transfected into Bel-7402 cells by liposome transfection， the expression of BATF2 protein was detected by Western blot and the effect on cell proliferation was detected by MTT method. Result： The results of double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the eukaryotic expression vector pcDNA3.1-BATF2 was successfully constructed. The protein expression of BATF2 in pc-DNA3.1-BATF2 group was higher than those in blank control group and PCDNA3.1 group （P<0.05）. After transfection for 48， 72 and 96 h， the OD values of Bel-7402 cell proliferation in pcDNA3.1-BATF2 group were lower than those in blank control group and pcDNA3.1 group （P<0.05）. Conclusion： pcDNA3.1-BATF2 eukaryotic expression vector is successfully constructed and transfected into Bel-7402 cells to increase the expression of BATF2 protein， and the overexpression of BATF2 can significantly inhibit the proliferation ability of Bel-7402 cells.

[Key words] BATF2 Eukaryotic expression vector Bel-7402 cells Cell proliferation

First-author’s address： School of Basic Medical Science， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.19.007

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其具有高复发、高病死率等特点，严重危害患者的身心健康[1]。肝癌的发生与其他癌症一样，是一个多步骤、多因素共同作用所引起的复杂病理过程[2]。科学家们一直致力于挖掘肝癌的发病机制及其治疗方法，而抗癌基因的研究一直是肝癌研究的热点。碱性亮氨酸拉链转录因子2（BATF2）是2008年由Su等[3]通过差减杂交技术发现的抑癌基因，其因结构与激活转录因子ATF相似而得此命名。BATF2被检测到在多种组织中广泛表达，而在多种肿瘤细胞中表达下降或缺失，其与多种肿瘤的发生发展关系密切[4]。目前关于BATF2与肝癌的相关报道相对较少，其在肝癌中的具体分子机制有待阐明。因此本研究构建了pcDNA3.1-BATF2过表达载体并转染肝癌细胞Bel-7402，以观察BATF2对肝癌细胞Bel-7402细胞增殖的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌细胞株Bel-7402（购于中科院上海细胞生物学研究所）。仪器和试剂：电子天平（METTLER TOLEDO）、酶标仪（瑞士Tecan）、低温离心机（德国eppendorf）、BATF2抗体和GAPDH抗体（武汉三鹰）、羊抗兔二抗（Abacm）、MTT粉末（Sigma）、RPMI-1640培养基和胎牛血清（Hyclone）、6孔细胞培养板和96孔细胞培养板（Corning）、DMSO（Solarbio）。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-BATF2质粒的构建及鉴定 利用Trizol法提取正常人外周血单核细胞RNA并将其反转录成cDNA。再以cDNA为模板，利用高保真酶将BATF2全长序列通过PCR扩增出来。BATF2引物序列包括：上游引物BATF2-F：5’-GCTCTAGAATGCACCTCTGTGGGGGCAATGG-3’（XbaI）;下游引物BATF2-R：CGGAATTCTTAGAAGTGGACTTGAGCAGAGGAG（EcoRI），片段大小为825 bp。扩增条件：PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳对目的基因进行回收，利用XbaI和EcoRI对pcDNA3.1-HA空载体和目的基因进行双酶切，再一次通过1%琼脂糖凝胶电泳回收双酶切片段。利用T4 DNA连接酶将目的基因连接到线性化的pcDNA3.1上，

16 ℃连接过夜。将连接后产物用热激发转化到DH5α感受态中，涂布在含氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆培养后提取质粒进行双酶切鉴定并将酶切开的质粒测序。

1.2.2 细胞培养 用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640完全培养基，置于5% CO2、37 ℃恒温恒湿的培养箱内培养，每天换液1次。

1.2.3 pcDNA3.1-BATF2质粒转染 将5×105个/孔的Bel-7402细胞接种于6孔板中，每孔加入2 mL RPMI-1640完全培养液，待细胞达到90%融合度时，弃去培养基，每孔加入500 μL Opti-MEM培养基。依照Lipofeetamine 3 000 Reagent说明书进行pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-BATF2质粒的转染。

1.2.4 Western blot检测BATF2蛋白的表达 转染48 h后收集转染细胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，应用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。定量后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，然后加一抗37 ℃孵育5 h，TBST洗涤4次，加二抗室温孵育1 h，TBST洗涤4次，ECL显影，凝胶成像系统拍照。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖 细胞转染后继续培养48 h，消化细胞，5 000个/孔接种于96孔板中，细胞完全贴壁后每隔24 h使用MTT试剂对细胞增殖情况进行检测。检测时，每孔加入20 μL MTT试剂，37 ℃孵育4 h，490 nm波长检测OD值。

1.3 统计学处理 应用SPSS 22.0软件对实验数据进行分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BATF2载体的构建及鉴定 提取pcDNA3.1-BATF2质粒，经XbaI和EcoRI双酶切后可在832 bp处观察到特异性条带，与预期结果一致。双酶切以及测序结果显示pcDNA3.1-BATF2表达载体构建成功。见图1、2。

2.2 转染pcDNA3.1-BATF2质粒后BATF2表达的鉴定 Western blot结果显示，空白对照组BATF2相对表达量为（0.082±0.009），pcDNA3.1组和pc-DNA3.1-BATF2组BATF2相对表达量分别为（0.086±0.011）、（0.301±0.028）;pc-DNA3.1-BATF2组BATF2蛋白表达量高于空白对照组与pcDNA3.1组（P<0.05）。见图3。

2.3 过表达BATF2对Bel-7402细胞增殖的影

响 MTT结果显示，空白对照组、pcDNA3.1组和pc-DNA3.1-BATF2组转染24 h后OD值分别为（0.354±0.012）、（0.346±0.021）和（0.337±0.017）;空白对照组、pcDNA3.1组和pc-DNA3.1-BATF2组转染48 h后OD值分别为（0.685±0.024）、（0.712±0.019）和（0.614±0.019）;空白对照组、pcDNA3.1组和pc-DNA3.1-BATF2组转染72 h后OD值分别为（0.912±0.026）、（0.866±0.028）和（0.712±0.023）;空白对照组、pcDNA3.1组和pc-DNA3.1-BATF2组转染96 h后OD值分别为（1.014±0.031）、（0.995±0.034）和（0.753±0.025）。转染48、72、96 h后，pc-DNA3.1-BATF2组Bel-7402细胞增殖的OD值均低于空白对照组和pcDNA3.1组（P<0.05）。见图4。

3 讨论

肝癌已成为全球恶性肿瘤发病率第六位的肿瘤，其病死率更是排在了第四位，世卫组织预测2030年全球范围内死于肝癌的人数将达到100多万[5]。2018年全球新发肝癌病例约有84万例，死亡病例约有78万[6]。我国又是一个肝癌大国，肝癌患者的发病率和死亡率都超过了世界平均水平[7]。2018年我国新发肝癌病例约39万，占全球肝癌新发病例的46.71%，死亡病例约37万，占全球肝癌死亡病例的47.20%[6]。雖然近年来对肝癌的治疗取得了巨大的进展，但其仍然严重威胁着患者的健康和生命安全。肿瘤的发生发展是一个复杂的生物学过程，伴随着抑癌基因的失活和原癌基因的激活[7-8]。抑癌基因在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，抑癌基因能够通过阻滞细胞周期、促进细胞凋亡来控制肿瘤细胞异常增殖，除此之外，某些抑癌基因还能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，从而发挥抑癌的功能[9-12]。因此研究抑癌基因在肝癌发生发展中的作用对于肝癌的预防和治疗具有重要意义。

BATF2基因由3个外显子组成，共含有2 142个碱基对，其编码274个氨基酸残基的蛋白质[13]。AP-1能够调控正常细胞的癌性转染，在癌症的发生发展中发挥重要作用，报道显示，AP-1在90%以上的恶心肿瘤中存而BATF2能够与AP-1结合，但由于其没有转录激活结构域，使得AP-1不能起始转录，从而起到抑制AP-1活性的作用[14-16]。早期研究发现BATF2与前列腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌等多种恶性癌症的发生和预后有着密切的关系，其在这些癌症中常被检测到表达缺失，而在这些癌症对应的正常细胞中却被检测到表达稳定[17]。Ma等[18]研究发现BATF2表达阳性的肝癌患者平均生存时间显著高于BATF2表达缺失的患者，并且BATF2表达与肿瘤分期和患者年龄具有相关性。Liu等[19]在结直肠癌细胞系中过表达BATF2，结果发现BATF2在抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡的同时还能够抑制癌细胞的迁移和侵袭。

目前国内外关于BATF2在肝癌中的作用研究鲜有报道，本研究从正常人外周血单核细胞中调取了BATF2基因全长编码序列，并连接到了pcDNA3.1真核表达载体上，成功构建了pcDNA3.1-BATF2重组质粒，并通过双酶切法和测序法进行了验证。通过Lipofectamine 3 000 Reagent转染试剂将重组质粒转入肝癌细胞Bel-7402后，经Western Blot鉴定，转染前后BATF2蛋白表达水平变化明显，进一步验证了pcDNA3.1-BATF2重组质粒构建成功。薛龑等[20]研究发现慢病毒转染BATF2基因48 h后，过表达BATF2的人红白血病Kasumi-1细胞增殖速度减慢，并且在72 h后与NC组细胞增殖速度出现显著差异（P<0.05）。该发现与本研究一致，过表达BATF2同样也能够抑制肝癌Bel-7402细胞的增殖，说明其在肝癌的发生发展中发挥作用，但其具体作用机制还需要进一步研究。

总之，本研究证实了BATF2可以在肝癌细胞中过表达仅仅是研究的前期准备阶段，下一步将更加深入的研究BATF2对肝癌增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为，力求阐明BATF2在肝癌中的作用及其具体机制。

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（收稿日期：2020-09-11） （本文编辑：田婧）