细小动脉硬化性脑小血管病动物模型☆

魏佳婷 陈艺聪 曾进胜

细小动脉硬化性脑小血管病（arteriolosclerotic cerebal small vessel disease，aCSVD）是最常见的脑小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）类型[1]，明确 aCSVD 的病理机制是探索其诊疗手段的关键所在，复制合适的动物模型对aCSVD的病理机制或治疗靶点等的研究具有重要意义。因此，本文将从行为学、影像学和病理改变等角度对目前常用的 aCSVD动物模型进行综述，为建立更接近临床实际的 aCSVD动物模型提供参考。

1 模型动物选择

啮齿类动物是目前最常用于构建aCSVD模型的动物，其主要优势有成本-效益比低、繁育周期短和脑体积小，适于行全脑切片。而且，随着基因编辑技术在啮齿类动物中的应用日趋成熟，啮齿类动物已成为研究分子机制和探索治疗靶点的重要工具。超高场强磁共振的应用也促进了啮齿类动物神经影像学的发展[2-3]。但啮齿类动物模型也存在显著的不足之处，啮齿类动物神经系统解剖结构、生理和行为学与人类差异大，限制了其研究结果的临床转化。比如，人类脑白质非常丰富，约占全脑体积 50%，而且尸检结果显示脑白质损害是人类aCSVD的重要病理改变，但啮齿类动物脑白质量少，仅占全脑体积14%，与人类差异大，降低了其在脑白质高信号等研究中的应用价值[4-6]。而且人类大脑的脑回和脑沟丰富，但啮齿类动物为无脑回动物，各脑区之间缺乏明确的分界标志[7]。另外，研究显示阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与aCSVD密切相关[8]，虽然啮齿类动物已广泛应用于睡眠障碍的研究中，但其睡眠特征与人类截然不同，首先，人类为单相性或双相性睡眠，而啮齿类动物为多相性睡眠；其次，人类为夜间睡眠，啮齿类动物则昼伏夜动；最后，与人类相比，啮齿类动物的快速动眼睡眠和非快速动眼睡眠周期显著缩短。因此，如果利用啮齿类动物研究睡眠障碍与aCSVD之间的关系，其结果能否延伸至人类仍不明确[9-10]。

近年来，有研究者采用非人灵长类动物（non-human primate，NHP）构建 aCSVD模型[11-15]。与啮齿类动物模型相比，构建NHP动物模型的主要不足包括繁育成本高和伦理要求更严格。但NHP具有啮齿类动物无法比拟的优势，其神经系统解剖结构、血流动力学、生理和行为学与人类更为相似。比如，NHP的大脑白质体积占比与人类相似，并且具有脑回脑沟结构，因此更适用于脑白质高信号或脑萎缩等的基础研究[7]；另外，NHP的睡眠觉醒周期、睡眠结构、长度和稳定性都与人类接近[16]，在探索睡眠障碍与aCSVD相关性的研究中，其应用价值高，而且，针对NHP的行为学评估方法和睡眠行为监测方法都已建立[15，17]，这也提高了NHP应用于aCSVD相关研究中的可行性。再者，神经影像学是 aCSVD研究的重要部分，不同于啮齿类动物，NHP对磁共振检查的场强要求较低，目前临床上常用的3.0 T磁共振也适用于NHP的影像研究[18-19]。因此，在aCSVD的临床前研究中，NHP具有啮齿类动物无法取代的地位。

2 模型构建方法

目前常用于复制CSVD动物模型的方法主要包括慢性低灌注、微小栓子血管栓塞、激光诱导穿支动脉闭塞和慢性高血压导致的CSVD模型等，其中仅慢性高血压导致的CSVD模型存在细小动脉硬化的病理改变，因此成为复制aCSVD动物模型的重要方法。该方法多采用啮齿类动物或NHP，其中常用的啮齿类动物模型包括易卒中型自发性高血压大鼠、易卒中型肾血管性高血压大鼠和血管紧张素II诱导慢性高血压导致的aCSVD模型，NHP动物模型则主要通过胸主动脉狭窄复制慢性高血压导致的aCVSD模型。

2.1 易卒中型自发性高血压大鼠（stroke-prone spontaneously hypertensive rats，SHRSP） 19 世纪 60 年代，日本京都大学研究人员发现部分雄性Wistar大鼠具有自发性高血压，于是研究人员将这些雄性大鼠与血压稍高于平均水平的雌性大鼠进行交配，接着从所得的F1代中筛选收缩压大于150 mmHg的子代，并进行近交，近交约20代后，最终形成了所有成年雄性和雌性大鼠均发生自发高血压的近交系自发性高血压大鼠 （spontaneous hypertensive rats，SHR）[20]，SHRSP是在 SHR的基础上给予特殊的高盐低蛋白饮食发展而来的[21]。9～12周龄时，SHRSP血压可达 200 mmHg以上[22-23]。24周龄时，新物体识别实验（novel-object recognition test，NORT）和 Morris 水迷宫实验显示SHRSP的非空间记忆能力显著下降，而空间学习能力没有显著受损[24]。SHRSP在9～12月龄时出现自发性皮层和皮质下卒中，包括出血性和缺血性卒中，卒中发病率约80%[22-23]。在出现脑卒中症状的SHRSP大鼠中，MRI上可以观察到缺血性卒中、出血性卒中病灶和脑白质高信号病灶，动态对比增强磁共振显示病灶的血脑屏障渗透性显著增强，动脉自旋标记显示病灶脑血流量显著下降[25]，而在尚未出现卒中症状的SHRSP中，MRI上则尚不能观察到脑白质高信号病变[26]。小动脉内皮功能障碍和血脑屏障受损是 SHRSP的早期病理改变，3～5周龄时，SHRSP虽尚未出现高血压，病理结果却显示其已出现内皮功能障碍和内皮细胞紧密连接蛋白减少[27]。随着年龄增长，SHRSP小动脉病变逐渐加重，双光子活体光学成像显示，17～28周龄时其小动脉病变主要表现为血管壁完整性受损、红细胞流速减慢和管壁红细胞附着，30～32周龄时小动脉管腔中红细胞栓塞形成显著增多[28]，而且在病变严重的小动脉壁上可以观察到淀粉样蛋白沉积[28-29]。在出现脑卒中症状的SHRSP中，病理显示其脑小动脉病变包括大分子物质渗出、血管壁重构、管腔狭窄、管腔栓塞，脑组织呈海绵状改变，即脑组织疏松和空泡形成[25]，但是在尚未出现卒中症状的SHRSP中，病理只能观察到脑小动脉病变，尚未出现显著的脑白质脱髓鞘或空泡形成[26]。

慢性低灌注可促进SHRSP的脑白质病变，对12周龄的SHRSP行单侧颈动脉闭塞术，术后动态对比增强磁共振显示其白质渗透常数显著增大，弥散张量成像显示其表面弥散系数显著增大，各向异性系数显著减小，提示血脑屏障受损和脑白质微结构损害加重。病理显示，与SHRSP假手术组相比，单侧颈动脉闭塞术后，内皮细胞紧密连接蛋白表达进一步下降，脑白质中IgG渗出显著增加，提示血脑屏障受损加重，血脑屏障受损与星形胶质细胞中HIF-α和MMP表达上调密切相关[30-31]。

SHRSP可较好地模拟人类aCSVD的临床症状、影像学和病理改变，慢性低灌注的 SHRSP可进一步模拟临床上高血压和颈动脉狭窄共同作用导致的aCSVD。但是，该模型的遗传背景特殊，不能排除遗传因素对血管病变或脑实质病变的影响。

2.2 易卒中型肾血管性高血压大鼠（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP） 该模型采用内径0.3 mm的银夹缩窄大鼠双侧肾动脉近腹主动脉端，成功复制肾素-血管紧张素-醛固酮系统依赖的慢性高血压。术后 12～20周 RHRSP血压可升至～200 mm Hg，术后 6～34周，～60%的RHRSP出现神经系统症状，包括偏瘫、四肢麻痹和癫痫发作等，其发病率显著高于单侧肾动脉狭窄模型[32]。术后20周Morris水迷宫实验显示 RHRSP的空间学习能力显著受损[33-34]。MRI T2加权序列显示严重脑白质高信号病灶形成，其中以胼胝体和外囊最为显著[34]。病理显示其脑白质出现显著脱髓鞘、神经纤维丢失和空泡形成，其中以胼胝体和外囊最为显著，脑白质中白蛋白渗出显著增多、星形胶质细胞和小胶质细胞显著增生、TNF-α水平显著升高，提示血脑屏障受损和炎症反应增强[33-34]。梗死或者出血病灶主要位于皮层、顶叶和枕叶脑白质，小脑和基底节卒中灶较少见，梗死灶由小动脉闭塞引起，出血灶则由小动脉壁纤维素性坏死或者微动脉瘤破裂导致[32]。小动脉病理改变包括血管壁α-平滑肌肌动蛋白表达显著上调、平滑肌细胞增生、胶原蛋白I/IV沉积显著增加、管壁纤维素性坏死、透明变性、管壁增厚和管腔狭窄[32-34]，除了小动脉病变，侧脑室附近的小静脉壁胶原蛋白-I/IV沉积也显著增加[35]。

慢性低灌注可进一步促进RHRSP的脑白质病变，与RHRSP相比，双侧颈动脉闭塞的RHRSP的空间学习能力进一步下降，病理显示其弥漫性脑白质病变、内皮细胞紧密连接蛋白减少、血脑屏障受损和小静脉壁胶原蛋白-I/IV沉积加剧[35]。

RHRSP可较好地模拟人类aCSVD的临床症状、影像学和病理改变，RHRSP联合慢性低灌注可进一步模拟临床上高血压和颈动脉狭窄共同作用导致的aCSVD，而且与SHRSP相比，RHRSP能够避免遗传因素对血管或脑实质病变的影响。其不足是不同的大鼠个体之间肾动脉直径存在差异，实际建模时难以统一肾动脉缩窄程度。

2.3 血管紧张素II（Angiotensin II，Ang II）诱导高血压该模型使用Ang II诱导啮齿类动物形成高血压，既往研究通常采用皮下注射的方法间断给药，现在则主要通过皮下埋泵的方法持续给药，给药速度一般为400～1000 ng/（kg·min），血压改变程度和给药速度相关。Ang II[800～1000 ng/（kg·min）] 持续给药 4 周后 C57Bl/6 小鼠收缩压升至170 mmHg[36]，NORT显示其非空间记忆能力显著受损，常规 MRI和 DTI显示小鼠脑室体积增大、海马萎缩、脑白质各向异性系数值减小，但是尚未观察到脑白质高信号，提示白质微结构受损，但尚未引起显著髓鞘脱失，这可能与观察时间较短有关[37]。病理结果显 Ang II诱导的高血压小鼠的穿支动脉呈向心性重构，表现为管腔狭窄和管壁/管腔比值增大[36]。此外，研究显示肾素-血管紧张素系统的各个组分亦均在大脑中独立存在，Ang II除了通过引起高血压导致脑小血管病变之外，还可直接作用于内皮细胞和周细胞Ang II 1型受体（angiotensin II type 1 receptor，AT1R），引起小动脉内皮素-1合成增加，内皮细胞功能障碍，微循环血管阻力增大[38]，并促进神经炎症和氧化应激反应。与AT1R不同，表达于大脑中的Ang II 2型受体（an giotensin II type 2 receptor，AT2R）具有抗神经炎症和神经保护作用[39]。

Ang II诱导高血压能够模拟临床高血压引起的小动脉病变和脑白质微结构受损等，可用于早期脑白质微结构受损的研究，但是Ang II诱导高血压仅适用于小动物，而大动物如NHP等由于体重大和观察周期长，其药物需求大，成本-效益比高，使得Ang II诱导高血压在大动物中难以应用。而且，Ang II引起脑血管病变的机制并不限于高血压，Ang II还可直接作用于大脑中的肾素-血管紧张素系统，使得慢性高血压导致的aCSVD的研究变得更加复杂。

2.4 胸主动脉缩窄 MOSS等[13-15]采用血管夹夹闭恒河猴部分胸主动脉腔径，并用缝线缝合夹闭的部分管腔，使其胸主动脉腔径缩窄至2.0～2.5 cm，狭窄率达75%～80%。术后狭窄部位以上血压平均水平可达170 mmHg/100 mmHg，狭窄部位以下血压平均水平为80 mmHg/50 mmHg。术后1年，延迟样本非匹配任务 （delayed non-matching to sample test，DNMS） 和概念变换任务 （concept set-shifting task，CSST）测试显示术后收缩压＞150 mmHg的恒河猴的注意力、短期记忆和执行功能显著受损，而术后血压轻度升高（＜150 mmHg）的恒河猴的认知功能受损不明显。病理结果显示其小动脉病变主要表现为血管壁增厚，但纤维蛋白原渗出不明显，并且未观察到节段性小动脉坏死、微动脉瘤形成或动脉粥样硬化等尚未观察到，脑实质病理改变主要表现为大脑皮层、白质、小脑和脑干微梗死灶形成（直径＜500 μm），以内囊、放射冠和半卵圆区最为显著，梗死灶形状不一，皮层微梗死灶主要表现为神经元丢失，白质微梗死灶则表现为有髓纤维丢失，两者均伴小胶质细胞激活和星形胶质细胞增生，但尚未观察到显著脱髓鞘、腔隙性梗死或微出血。不足的是，研究者未对该模型的神经影像学改变进行动态观察。该模型脑实质病变以微梗死为主要病理改变的原因可能有两个：一是微梗死为aCSVD的早期表现，而术后观察时间较短，仅 1年，因此病理改变仍以微梗死为主，尚未出现其他病理改变；二是胸主动脉狭窄虽然成功构建了高血压模型，但此时大脑处于高灌注条件下，而临床上aCSVD患者常合并颅内外大动脉狭窄，处于低灌注状态，与该动物模型明显不同，因此该动物模型无法成功复制aCSVD的病理改变。

胸主动脉狭窄恒河猴模型可模拟慢性高血压导致的微梗死，并采用复杂的行为学评估方法对其认知功能改变进行研究，证实高血压与执行功能和注意能力受损密切相关。但是该模型亦具有显著不足之处，首先，胸主动脉狭窄操作难度大，难以推广。其次，该模型中，恒河猴脑部处于高灌注状态，与临床上aCSVD患者的血流动力学明显不同。最重要的是，该模型的病理改变和aCSVD患者的病理改变仍存在显著差异，其脑实质中未出现腔隙性梗死或显著脑白质脱髓鞘病灶，小动脉病变以血管壁增厚为主，而缺乏人类aCSVD所具有的纤维素样坏死、或透明变性等改变。

除了胸主动脉缩窄，有研究亦使用肾动脉狭窄的方法复制慢性高血压非人灵长类动物模型，但是其所得结论不一。WOOD等[40]通过单侧肾动脉狭窄构建慢性高血压狨猴模型，术后仅约40%的狨猴出现高血压，并且在术后6周，狨猴血压开始回落，而PANEK等[41]亦通过单侧肾动脉狭窄，使肾动脉血流速度下降50%，成功复制慢性高血压食蟹猴模型，术后4周75%（6/8）的食蟹猴血压显著升高，平均血压由95 mmHg升至130 mmHg，并维持至术后 24周。GOLDBLATT[42]通过双侧肾动脉狭窄术构建慢性高血压猕猴模型，术后猕猴血压显著升高，收缩压可达200 mmHg，但是该模型术后猕猴死亡率高，这可能与该研究使用同一大小的血管夹缩窄肾动脉有关，不同猕猴个体之间动脉直径变异大，使用同一大小的银夹可导致部分猕猴肾动脉严重狭窄，术后出现严重肾衰，导致死亡。但是，至今尚无研究观察肾血管性高血压非人灵长类动物模型是否存在与人类 aCSVD相似的症状、影像学或病理改变。

3 总结和展望

aCSVD的临床诊断和治疗仍面临许多局限和挑战，构建能够精确模拟人类aCSVD病理改变和临床过程的动物模型对推动aCSVD临床研究具有重要意义。慢性高血压导致的aCSVD模型能较好地模拟人类aCSVD病理生理改变，目前，aCSVD动物模型的复制多采用啮齿类动物，但啮齿类动物的大脑解剖结构、生理和行为学等方面与人类之间差异较大，限制了其研究结果的临床转化。复制慢性高血压非人灵长类动物模型将为aCSVD的临床前研究提供较理想的实验工具，目前胸主动脉狭窄是用于复制慢性高血压非人灵长类动物模型的主要方法，但是该模型脑部高灌注状态和病理改变等与人类aCSVD仍存在明显差异。RHRSP在aCSVD研究中的成功应用，提示双侧肾动脉狭窄导致慢性高血压可能是构建aCSVD非人灵长类动物模型的可行方法。